新一代测序技术
下一代测序的起点，NGS)2005年以来的罗氏454、Illumina GA/HiSeq、Life SOLiD/Ion Torrent、PacBio RS等发明。新技术大大提高了测序通量，降低了测序成本。本文主要介绍华大平台的Illumina测序技术、太平洋生物科学SMRT RS测序技术、牛津纳米孔测序技术、DNBSEQ TM测序技术。
该技术是目前应用最广泛的下一代基因组测序平台，采用边合成边测序的技术，实现大规模并行测序。最早是由Solexa公司开发的，所以也叫Solexa测序技术。Illumina测序平台有多种仪器可供选择，如适用于测序中心和测序公司的HiSeq系列测序仪，适用于中小型实验室和医院医疗诊断测序的MiSeq和NextSeq500测序仪，以及专门用于医疗诊断测序的MiniSeq。排序模式分为高通数量模式和快速模式。其中，高通模型兼容更多的样本量和应用类型；而快速模式测序速度更快，单次操作成本更低。
Solexa测序技术的原理在知乎上的网友“星空理想主义者”和“”等平台上的“Z_Y_H”都有详细介绍:
(详细分析二代测序原理！——星空理想主义者的文章——知乎)；
(illumina双端测序-z _ y _ h上的文章-)。
以下只是简单总结。该方法的第一步是建立测序文库制备(图1)。将基因组断裂成小片段，两端完成，3’加尾，加入Illumina特殊接头(一端寡T)，含有酶切位点，为环状非互补链，形成“球形”接头。当用限制性内切酶切割时，形成一个“Y”形末端，这样就可以一步一步地复制。在双链末端添加与后续扩增引物互补的片段(通过两次重复实现，两端引物序列不同，设为P5和P7)，在引物内侧添加标记(两端标记不同)。如有必要，可用Taq酶使其达到平端。要做好上述工作，就要进行纯化，只有正确添加了接头的序列才用于后续反应，去除引物、酶等杂质。以上操作可以一次对整个库进行。
纯化后，对文库进行扩增和聚类，目的是扩增测序信号。在具有八个泳道的流动池上，变性测序文库与固定在泳道玻璃壁上的寡核苷酸(P5’，P7’)特异性互补结合，并在一轮复制(5’-->:3’)后，切割并洗去模板，固定在芯片上的寡核苷酸合成互补链。然后开始桥扩增，将含有DNA片段的文库扩增至约1000个拷贝，每个拷贝具有相同的DNA序列，从而形成一个簇。最后的扩增产物退化为单链，可用于成对末端测序。然而，通常的做法是通过使用甲酰胺基嘧啶葡糖苷酶(Fpg)的8-氧代鸟苷(8-oxog)的选择性切割，从接头选择性切割正向或反向序列，以避免过近的链间距对序列添加的影响。如果先切断反向序列，在测量后，重复上述反应直到选择性切割，切断正向序列并进行反向测序。
第三步是测序过程。Illumina平台使用SBS技术和3’-阻断可逆终止子技术进行测序。3’-末端可逆屏蔽终止子技术使用带有荧光标记的特殊核苷酸。该核苷酸的3’-羟基被化学基团保护，导致在每次DNA链合成中只能添加一个核苷酸。但在记录荧光图像时，化学屏蔽基团被酶切法切断，3’-末端恢复连通性，等等。可以想象，起初变性文库中含有模板-互补链(两个标签没有区别)，在一个过程中同时测序，所以在收集单读测序结果时需要识别互补链，避免序列拼接混乱。正反双端测序大大提高了测序效率。
由于Illumina测序技术采用的是扩增聚类的信号放大原理，其读出长度达不到一代测序的水平，因为扩增到几百个碱基后，由于核苷酸浓度和酶活性的影响，簇内碱基的添加不再同步，如果不同步，信号就会混乱，导致读出序列不准确。
该技术是太平洋生物科学公司推出的单分子实时DNA测序技术，基于边合成边测序的原理。该技术的主要特点是长阅读，平均序列在10kb以上，最长阅读长度可达40kb。它以SMRT细胞为测序载体。SMRT池是一片厚度为100nm的金属，其一面有150000 (2014)个直径为几十纳米的小孔，称为零模波导，ZMW)，又称纳米孔。测序时，系统将测序文库、DNA聚合酶和带有不同荧光标记的dDNA放在纳米孔底部进行DNA合成。通常，纳米孔固定DNA聚合酶菲尼克斯和DNA模板。
这种方法的特别之处在于测序文库不需要扩增，因为零模波导可以大大消除噪声荧光背景，单分子反应释放的荧光也可以被准确记录。另外，利用SMRT技术检测到标记的荧光基团与脱氧核苷酸的结合位置不在碱基上，而是在5’磷酸基团的第三个磷酸基团上，这样在dNTP互补结合测序模板和测序引物的缩合反应后，荧光基团与焦磷酸一起被切断，省略了酶切步骤。
2014年，牛津纳米孔公司推出了几款基于纳米孔测序技术的测序仪，如MinION、PromenthION、GridION等。其基本原理是在充满电解质的纳米孔两端加上一定的电压，就可以很容易地测出通过纳米孔的电流强度。纳米孔的直径只能容纳一个核苷酸通过。当核苷酸通过时，纳米孔被核苷酸堵塞，通过的电流强度变弱。由于四种核苷酸碱基的空间构象不同，当它们通过纳米孔时，减弱的电流强度的变化是不同的。因此，只有检测DNA通过纳米孔时电流强度的变化，才能实现实时测序。
这种方法也不需要文库扩增，可以长时间、实时、单分子阅读，可以大大降低测序成本。
这项技术源于完全基因组学，在华大得到改进。根据华大官网的文章，简要说明这种方法的原理。
根据图2的流程，BGI使用DNA纳米球技术来扩增DNA序列，其中DNA被分成大约100个碱基对的片段。此线段的每一边都与第一个连接器连接，即连接器1。扩增连接的DNA片段，并通过结合两端的接头形成环连接的序列片段。切割环状DNA片段以加入第二个接头，即接头2，并重复扩增和环化过程。曾经四种接头，即接头1，2，3，4(四种接头的序列不同，有的是与引物互补的寡核苷酸，有的是标记等。)添加到DNA片段中，通过滚环扩增最终的环状DNA以产生DNA纳米球，DNB)。在滚球扩增中，并不切断每个拷贝，而是在不影响延伸的情况下，扩增后用一定的方法变性，得到一组多拷贝的纳米球。纳米球固定在芯片上的网状孔中。
采用探针-锚定连接测序(CPAS)和多重置换扩增双端测序(MDA-PE)增加测序的阅读长度，可检测到100bp/150bp的双端序列。到目前为止，还没有详细公开组合探针锚定聚合技术。MDA-P的具体原理是通过复制延伸对第一条链进行测序后，在具有链置换功能的高保真聚合酶作用下，去除第一条链模板，合成第二条链，通过DNA分子锚对第二条链进行测序。
与其他二代测序相比，DNBSEQ TM测序技术以DNB为基础，用原始模板进行扩增，不同于PCR的指数级增长。最重要的是在放大过程中不会积累误差。
程皓枫。下一代基因组测序技术[M]。第一版。北京:科学出版社，2016。
【2】详细分析二代测序原理！——星空理想主义者的文章——知乎。
[3] illumina双端测序-Z_Y_H篇-。
[4]华大科技-产品服务-全外显子测序-产品介绍。
[5]破译人类基因组:下一代测序——(1)——周静的文章——词汇学。