木霉系统发育研究的历史回顾
1.3.1.1蛋白质标记(同工酶分析)
评估遗传变异的常用方法是同工酶电泳。同工酶分析用于区分木霉菌的近缘种(Szekeres等，2006)，可以快速、经济地分析大量木霉菌株。不同的氨基酸序列导致不同的蛋白质特性，同时改变聚丙烯酰胺凝胶电泳中的移动速率(Rosendahl等，1992)。电泳后，通过比较已发表的染色光谱，可以直观地反映不同酶的多样性(Pasteur et al .，1988；哈里斯等人，1976).
Zamir等(1985)首次用同工酶分析描述了木霉菌种的特征，将来自不同地理位置的23株哈茨木霉菌株划分为5个类型。结果表明，同工酶电泳在种间水平上区分木霉菌种是非常有用的。Stasz等人(1988a)使用水平淀粉凝胶电泳来评估63种木霉酶在木霉系统发育的分支分析中的应用。Samuels等人(1994)使用淀粉凝胶分析23种酶来检测长枝木霉、拟康氏木霉和里氏木霉。Szekeres等(2006)发现7种合适的酶可以鉴定拟康氏木霉、康氏木霉或桔黄木霉，分类结果支持基于Bissetts(1992)形态特征的木霉分类系统。Grondona等(1997)分析了哈茨木霉15菌株的形态、生理、分子和生化特征，以及6个同工酶系统的99条同工酶谱带，通过数值分类将15菌株分为4个类群。Siddiquee等人(2007)研究了由14基因座编码的9种同工酶的电泳差异，以区分木霉菌种哈茨木霉、黄绿木霉和长枝木霉的47个菌株。Juck Zhang等(2012)从14种木霉中筛选出21株，利用植酸酶保守序列设计并融合引物P8205和P500-2，获得植酸酶基因片段，并建立系统发育树。结果表明，植酸酶基因序列具有多样性，这与基于ITS序列的分类结果基本一致。
可溶性蛋白凝胶电泳也是真菌鉴定和分类的重要方法。如陈嘉耐等(1999)利用可溶性蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析6个种26个木霉菌株的特征图谱，发现种间蛋白电泳图谱差异显著，种内菌株基本相同。肖兴龙等(2002)对61个不同木霉菌株进行可溶性蛋白电泳分析，结果表明哈茨木霉存在亚种分类群。
1.3.1.2 BIOLOG微孔板分析技术
BIOLOG微孔板分析法是一种群落水平的生理特征分析方法。利用Biolog GN系统，根据微生物不同的碳源利用能力，研究微生物的碳源利用方式是一种方法。Biolog GN微量滴定板的每个孔包含不同的碳源、其他营养物和四唑染料。将微生物悬液接种在微量滴定板孔中，由于不同微生物对不同单一C源的利用程度和强度不同，会产生不同的生化代谢反应，从而呈现不同的颜色。这种颜色的变化可以通过酶标仪进行测量和记录，从而获得微生物独特的“代谢指纹”。根据土壤微生物的代谢指纹，结合相关的计算机软件和现有的菌种库数据，可以对一些微生物进行分类和鉴定(Winding et al .，65438
Kubicek等人(2003)引入Biolog FF微孔板研究木霉菌种表型生理特性的差异。用光比色法测定木霉菌株对95种碳源的利用和线粒体活性(96 h，测浊度表示菌丝生长)。该技术可以提供物种特异性模式，有助于区分相似物种，但对了解系统发育关系没有帮助。Bissett等人(2003)在用ITS和EF-1a序列描述亚洲7个新种时，也使用Biolog方法确定了菌株的生理特性。从系统进化树中可以清楚地看到，B4系统进化树可以分为以下几个亚进化树:哈茨木霉、螺旋木霉和绿木霉。Druzhinina等人(2006a)利用Biolog微阵列技术评价了里氏木霉对95种碳源的利用，并比较了野生型、突变型和转化型菌株之间的差异。该技术的可重复性、简单性和高分辨率使其成为全面分析突变和转化菌株和基因功能的有力研究工具。
1.3.1.3 DNA序列(ITS)分析技术
真菌分类中分子工具的出现促使研究人员在20世纪90年代中期重新审视基于形态学的木霉菌分类系统。G.J.Samuels(美国马里兰州Beltsville)、T . Borner(FRG柏林)和C.P.Kubicek(奥地利维也纳)合作，带头修订Bissett的Longibrachiatum小组。所采用的技术包括各种分子标记技术(ITS1和ITS2序列分析，RAPD)，生理(同工酶分析)和表型特征，首次将包括该组木霉菌种在内的可能的性型作为研究对象(Kuhls et al .，1996，1997；塞缪尔斯，1996；萨缪尔斯等人，1998；特纳等人，1997).结果表明，长臂蕨类群在系统发育上是独立的，包括10个分类群，其中有4对是无性-有性的:H.schweinitzii/T.citrinoviride,、H.pseudokoningii/T.pseudokoningii,、H.jecorina/T.reesei和H.orientalis/T.longibrachiatum.长枝木类群是木霉属中较小的类群，与其他类群的亲缘关系较远。
当研究更大组的木霉菌时，形态特征和分子系统发育之间的关系变得复杂。Kindermann等人(1998)首次尝试分析木霉属的系统发育，采用rDNA的ITS1区序列分析的方法，发现厚囊类群实际上是一个侧系类群或分类单元。这一结果被后来对多个基因的研究结果所证实(库尔尼格-格拉丁格等人，2002；Chaverri等人，2003b).Lieckfeldt等人(1999)证明了绿色木霉的进化分支至少包含另一个物种，即曲霉菌，并发现了其他几条进化路线。Dodd等人(2003)也发现进化枝应该进一步分成几个分类单位。Lieckfeldt等人(2001)使用ITS序列分析来确定黄绿木霉的系统发育位置，其在木霉中是独立的，并且通过其非常慢的生长速率与其他物种相区别。Chaverri等人(2001)发现了绿锥虫的性阶段，并用ITS和tef-1序列对其进行了表征。结果表明，木霉与其有性阶段的关系可以通过分子手段得到证实，并认为该种与h . lixi(t . harzianum)关系密切。
1.3.1.4多基因研究(GCPSR)技术
自从Taylor等(2000)将遗传一致性分类学(GCPSR)的概念引入真菌的分子分类学以来，多基因研究方法被应用于木霉菌的分类学。Dodd等人(2000)的研究表明，ITS有时不足以解决密切相关的分类单元之间的关系，特别是在哈茨木霉和绿色木霉之间的关系中，tef-1和rpb2大内含子的组合是最合适的工具，但它不适用于所有分类单元的所有研究目的。Kullnig-gradinger等人(2002)合成了ITS、28S、mitSSU、tef1和ech42序列，用于更多种类的分析，结果进一步支持了厚囊菌组的二级分类。Samuels等人(2002)利用ITS和tef-1序列之间的关系来区分侵袭木霉和哈茨木霉，这两种细菌在显微镜下很难区分，但这两个分类单位仍然位于哈茨木霉的进化分支中
Dodd等人(2003)发现了T.atroviride的有性阶段，并利用ITS和EF-1a序列分析方法研究了其特征，区分出4个亚进化分支，其中一个局限于新西兰特有物种。此外，还发现绿色木霉和康宁木霉是异质的。暗绿色的H.atroviridis也明显不同于最早在竹子上发现的H.muroiana(两者之前也是难以区分的类型)。Chaverri等人(2003a)用四个序列证实了李西锥虫和哈茨锥虫之间的关系。在T.harzianum/H.lixii,可以区分出几个谱系，但是找不到用于清楚识别的形态特征。Lu等人(2004)继续Chaverri等人(2003a)的工作，采用ITS、ech-42和tef-1序列，集中于产生白色分生孢子的物种。研究结果表明，多孢木霉和菌毛木霉与Chaverri和Samuels(2003)关系密切。
Chaverri等人(2003c，2004年)使用RPB2和EF-1a序列研究了40种具有绿色子囊孢子的下核菌。这些物种不是单系物种，但它们都被认为是来自下核的物种。所描述的新进化分支包括氯孢菌属、绿孢菌属、异长孢菌属和凝胶状菌属，而黄孢菌不在基点上。Holmes等人(2004年)将卵形木霉描述为属于康宁木霉集合的内生菌。绿色木霉进化分支的异质性特征再次在tef-1序列中表达。Kraus等人(2004)描述了T.brevicom-pactum，它与藤黄蛭密切相关，在ITS和tef-1序列和生理特征上有相似性。虽然本种与藤黄木有亲缘关系，但其形态特征更接近于栖毛木，因此仍被认为是一个异质性种。这个物种是唯一能产生单端孢菌素和阿拉密菌素的物种。
Overton(2006年)修订了无性生殖属的分类。柠檬黄h .和垫状h .形成了一个明显的进化分支，硫代H.sulphurea是这个进化分支的姐妹分支，亚硫代h .以及原生甲藻(现为原生甲藻)farinosa和大甲藻是完全独立进化的。因此，下核群是异质的，但不能确定这些无性形式是原始状态下自然存在的，还是后续培养衍生的。在形态种康氏锥虫中，Samuels(2006)划分了12个系统发育种，它们分布在三个谱系中:①康氏锥虫、卵形锥虫+广泛分布的康氏锥虫等。②罗氏沼虾+奥地利沼虾；③斯氏嗜酸乳杆菌.地理系统的发展趋势表现在上面的一些类别中。该研究解决了重要生物防治物种——康氏柽柳的分类地位问题。
2008年，Degenkolb等人利用rpb2、tef1、ITS1、5.8 S和ITS2区域的序列分支技术，结合形态学和代谢物化学分析的手段，建立了短密木霉的进化分支，该分支与之前建立的藤黄菌进化分支最为接近。这个分支的成员包括T.brevicompactum、T.arundinaceum、T.trrrialbense、T.protrudens和Hypocrea rodmanii。除H.rodmanii外，所有成员均可产生毛孢子烯类毒素哈茨木霉A或Trichodermin，均可产生肽醇类抗生素，包括alamenthin。绿色T. viridesscens被认为是一个物种复合体。Jacklitsch等人(2013)通过添加ATP柠檬酸水解酶(acl1)基因分析并结合tef1和rpb2基因序列建立了12个系统发育物种:绿色锥虫s.str .副绿色锥虫、橄榄锥虫、绿色锥虫、trixiae锥虫、绿色锥虫、阿巴拉契锥虫、新锡锥虫、复合锥虫
1.3.1.5其他分析技术
根据产生的次生代谢产物的特征，对木霉菌进行了鉴定和分类。如Thrane等(2001)利用高效液相色谱(HPLC)对整个色谱基质的色谱图像进行分析，44个木霉菌株的分类结果与形态学分类和rDNA序列分析结果一致。本研究表明，木霉产生的次生代谢产物含有足够的信息，可用于木霉的分类和鉴定。还报道了通过质谱法对木霉属进行分类。Respinis等人(2010)使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析木霉蛋白质组或肽的质量指纹，将129个木霉菌株分为8个系统发育分支和25个不同的种，除了Saturnisporum和哈茨木霉(harzianum。