基因编辑RAW 264.7细胞系辅助炎症和破骨细胞生成的相关研究
RAW264.7是单核细胞/巨噬细胞样细胞系，其是来源于BALB/c微小RNA的艾贝尔森白血病病毒的转化细胞系。RAW 264.7是破骨细胞和炎症研究中最常用的体外模型之一。
1.？破骨细胞形成的研究:
已经证明RAW 264.7在RANKL的诱导下容易分化成破骨细胞。与原代破骨细胞的前体不同，RAW 264.7的分化不需要加入巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。
2.？炎症研究:
RAW264.7是筛选抗炎活性物质和研究炎症最常用的体外研究模型。在诱导剂(如脂多糖LPS)的作用下，RAW264.7细胞可模拟炎症反应，释放或上调多种炎症介质如一氧化氮(NO)、环氧化酶-2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等。
据报道，类风湿性关节炎(RA)影响全世界超过265，438+0万人。类风湿性关节炎是一种影响关节的自身免疫性炎症疾病。其特征是巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，滑膜成纤维细胞的增殖和关节的最终破坏。巨噬细胞在类风湿性关节炎的发病中起着重要的作用。RA炎性滑膜中巨噬细胞数量高于正常关节，与关节疼痛和炎症的严重程度呈正相关。许多药物已被批准用于治疗类风湿性关节炎、基因或细胞疗法。
在小鼠染色体16和人类染色体21的BIC基因中发现了MicroRNA 155(Mir-155)。在临床和实验模型中，miR-155与RA的发病机制有关，因为它在RA患者的滑膜和滑液巨噬细胞中上调。干扰miR-155 (KD)的SiRNA可以抑制促炎细胞因子的产生。miR-155可能通过多种方式参与RA的形成，其中一种方式是MiR-155靶向Src同源-2的三个非翻译区，包括肌醇磷脂酶1 (SHIP1)，它是炎症的负调节因子。因此，RA中miR-155的升高导致SHIP1水平降低，促炎细胞因子升高。
研究人员利用CRISPR/CAS9技术成功突变了小鼠巨噬细胞RAW264.7的内源性miR-155基因，获得了miR-155基因组敲除(GKO)克隆。进一步分析表明，miR-155 GKO克隆在LPS刺激下表达更高水平的SHIP1，但产生更少的促炎细胞因子。
通过使用miR-155 GKO克隆，去除miR-155将导致巨噬细胞产生的促炎细胞因子减少，从而证实了先前的观察，即增加的miR-155有助于RA患者细胞因子产生的持续水平。通过将miR-155模拟物转染回GKO克隆，研究人员可以重新引入miR-155效应。总之，这些结果表明内源性miR-155基因的突变可能导致前miR-155产物被截短，无法成熟为更短但稳定的miR-155。
NLR家族蛋白NLRP3是外源病原体和内源性损伤相关分子模式(DAMPs)的细胞质传感器。激活后，NLRP3与衔接蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase-1组装，形成NLRP3的炎症体，导致caspase-1的裂解和激活。活化的capase-1切割IL-1的细胞因子和IL-18的前体，使它们成熟并导致几种促炎细胞因子的释放，包括IL-1和IL-183的细胞因子。据报道，NLRP3炎症小体在各种炎症性疾病的发生发展中起着重要作用。抑制NLRP3炎性小体信号已被证明可有效缓解脓毒性休克、腹膜、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、T2D、多发性硬化、痛风和其他疾病。因此，NLRP3炎性小体是治疗各种炎性疾病的极好靶标。
利用CRISPR/Cas9在基因组水平直接破坏关键分子——NLRP3，不仅可以完全抑制nlrp 3炎性小体的激活，还可以避免抑制抗炎生物制剂和抑制剂脱靶途径的潜在风险。研究CRISPR/Cas9敲除NLRP3的策略有望成为治疗多种炎症性疾病的更有效方法。
在这项研究中，研究人员报告了一个系统化的传递系统CRISPR/cas9？将mCas9和gNLRP3封装成CLAN。CLAN是一种基于PEG -b- PLGA，辅以阳离子脂质BHEM-Chol的纳米粒，用于递送核酸治疗。在之前的工作中，研究人员已经将小干扰RNA、RNA适体和乙肝病毒CpG引入肿瘤细胞、心肌细胞、巨噬细胞或类血浆树突状细胞家族。
但mCas9/gNLRP3不同于其他核酸疗法，纳米颗粒的性质影响药物的输送效率。为了测试CLAN42是否能够有效地传递mCas9/ gRNA，研究人员将Cas9、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)*** mRNA (Cas9-EGFP mRNA，或mCas9-EGFP)和阴性对照gRNA (gNC)封装到选定的氏族(CLANmCas9-EGFP/gNC)中。用不同的CLANmCas9- EGFP/gNC转染骨髓来源的巨噬细胞。转染组骨髓基质细胞EGFP阳性率最高。接下来，研究人员通过转染稳定表达GFP (Raw264.7-GFP)的Raw264.7细胞(巨噬细胞系)和包裹mCas9和gRNA靶向GFP的CLAN (CLAN mCas9/GGFP)来检测基因敲除效率。转染组gfp基因敲除Raw264.7-GFP细胞的百分比最高，达到53.9%。通过给小鼠注射不同的CLANmCas9- EGFP /gNC，研究人员进一步证实了CLAN42在体内mCas9/gRNA的传播效率。注射组的腹腔巨噬细胞EGFP阳性率最高(48.4%)。综上所述，CLAN42因其巨噬细胞摄取能力最强，在mCas9/gRNA传递中最有效，CLAN42更适合于包裹mCas9/gNLRP3(命名为CLAN mCas9/gNLRP3)用于治疗各种炎症性疾病。
因此，研究人员通过调整阳离子脂质BHEM-Chol的重量和聚合物中PEG5K-b-PLGA11K的质量分数，建立了不同表面电荷和PEG密度的基团库。研究人员在体外和体内筛选家系，选择了一个较好的家系，将mCas9/gNLRP3导入巨噬细胞，通过破坏巨噬细胞中的NLRP3来改善mCas9/gNLRP3诱导的感染性休克、腹膜炎和HFD诱导的T2D。该研究为CRISPR/Cas9进入巨噬细胞并治疗各种炎症性疾病提供了一种有前途的策略。
结果表明CLANmCas9/ gNLRP3是治疗NLRP3依赖性炎症性疾病的一种有前途的方法。该研究还为通过纳米粒子介导的免疫细胞基因编辑治疗免疫相关疾病提供了范例。