DNA测序的测序技术
根据发展历史、影响、测序原理和技术的不同，主要有以下几种:海量平行签名测序、MPSS、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina (Solexa)测序、ABI固体测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序等基因分析仪(DNA测序仪)采用毛细管电泳技术代替传统的聚丙烯酰胺平板电泳，采用公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止子法)。因此，通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物是3’端带有四种不同荧光染料的单链DNA混合物，相差1个碱基，这样四种荧光染料的测序PCR产物可以在一个毛细管中电泳，避免了泳道。由于分子大小不同，毛细管电泳中的淌度也不同。当分子通过毛细管读数窗时，激光检测器窗口中的CCD(电荷耦合器件)摄像检测器可以逐个检测荧光分子。激发的荧光被光栅分割，以区分代表不同基底信息的不同颜色的荧光，图像在CCD相机上同步。分析软件可以自动将不同的荧光转换成DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果可以以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图谱或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一种用计算机自动控制，如自动灌胶、自动取样、自动数据采集和分析，测量DNA片段碱基序列、大小和定量的高级精密仪器。PE还提供凝胶聚合物，包括DNA测序凝胶(POP 6)和GeneScan凝胶(POP 4)。这些凝胶颗粒的孔径大小均一，避免了凝胶制备条件不一致对测序准确性的影响。主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳配件组成。计算机包括用于数据收集、分析和仪器操作的软件。它采用最新的CCD摄像检测器，将DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10 ~ 40分钟。
由于仪器具有DNA测序、PCR片段大小分析和定量分析的功能，可以进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析。除了常规的DNA测序，它还可以进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型和法医学。
一.准备工作
1的主试剂。BigDye测序反应试剂盒为BigDye Mix，内含四色荧光标记的ddNTP和PE专利的普通dNTP、AmpliTaq DNA聚合酶FS、反应缓冲液等。
2.pGEM-3Zf (+)双链DNA对照模板0.2 g/L，试剂盒配套试剂。
3.M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，是试剂盒的试剂。
4.DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA。模板浓度要调整，PCR反应取1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA浓度为0.2 g/L，即200 ng/μ L。
5.引物需要根据待测DNA片段设计正向或反向引物，配制3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μ L..如果重组质粒含有通用引物序列，也可以使用通用引物，如M13(-21)引物和T7引物。
6.去离子水或三重蒸馏水消毒。
7.0.2毫升或与0.5毫升PCR试管盖分开。
8.3 mol/L乙酸钠(pH5.2)称取40.8g NaAc·3H2O，溶于70 ml蒸馏水中，用冰醋酸调节pH至5.2，定容至100 ml，高压灭菌后分装。
9.70%乙醇和无水乙醇。
10.NAAC/乙醇混合物可在室温下储存10。NaAc/通过混合37.5毫升无水乙醇和2.5毫升3摩尔/升NaAc。
11.POP 6测序凝胶。
12.模板抑制试剂(TSR)。
13.10×电泳缓冲液。
14.自动DNA测序仪。
15.PCR仪器
16.台式冷冻高速离心机。
17.台式高速离心机或袖珍离心机。
二、PCR测序反应
1.取0.2 ml PCR管，用标记物标记，将管插入粒状冰中，并根据下表添加试剂:
用于测量添加了试剂的模板管的标准控制管
BigDye混合物1微升1微升
质粒DNA 1 μ l-
PGEM-3Zf (+)双链DNA-1 μ l
正向引物1 μ l-
M13(-21)引物-1μ l
无菌去离子水2微升2微升
总反应体积5 μl，不加轻质矿物油或石蜡油，PCR管盖紧，用手指弹性管混匀，稍离心。
2.将PCR管放在9600或2400 PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25个循环，扩增后温度设为4℃。
3.乙酸钠/乙醇法纯化PCR产物
1.离心混合物，并将扩增产物转移至1.5 ml EP管中。
2.加入25 μl乙酸钠/乙醇混合溶液，充分摇匀，置于冰上10 min沉淀DNA。在4℃下以12 000转/分钟离心30分钟，小心弃去上清液。
3.添加50μl 70%(V/V)的乙醇，洗涤沉淀物两次。4℃12000 r/min离心5 min，小心弃去管壁上的上清液和液珠，真空干燥沉淀10 ~ 15 min。
第四，电泳前测序PCR产物的处理
1.向离心管中加入12 μl TSR，剧烈摇动，让其充分溶解DNA沉淀，轻微离心。
2.将溶液转移到与盖子分离的0.2 ml PCR管中，并稍微离心。
3.在PCR仪上进行热变性(95℃2分钟)，然后在冰中淬火待用。
动词 （verb的缩写）在1计算机上操作。根据仪器的操作说明安装毛细管，校正毛细管的位置，手动填充胶水，并建立运行排序序列文件。2.仪器会自动将胶水注入毛细管，在1.2 kV下预电泳5分钟，根据编程的顺序自动进样，在1.2 kV下预电泳20分钟，在7.5 kV下电泳2小时..3.电泳结束后，仪器会自动清洗，充胶，进下一个样品，预电泳，电泳。4.每个样品的总电泳时间为2.5小时..5.电泳结束后，仪器会自动分析或打印出彩色测序图。
六、序列分析仪将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行比较。如果测序顺序已知，可以通过序列比对，将不同的碱基标上星号，提高工作效率。
七、仪器清洁和测序按仪器操作规程进行仪器清洁和维护。
八。计算
1.测序反应准确度计算公式:100%-差异碱基数(不含N数)/650×100%。
2.差异碱基是指确定的DNA序列与已知的标准DNA序列不同的碱基，N是仪器无法读取的碱基。SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种非放射性序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染为放射性或荧光提供了一种更快更便宜的替代方法。测序结果可在当天获得；电泳完成后90分钟即可读出序列，这是常规放射性测序无法做到的。此外，SILVER SEQUENCETM系统使用未修饰的5’OH寡核苷酸作为引物，这降低了专门修饰的寡核苷酸的成本。该系统不需要在放射性方法中小心操作同位素，也不需要昂贵的荧光或化学发光技术试剂。此外，不需要像大多数荧光方法一样使用仪器检测序列带。
Taq DNA聚合酶在95℃具有很强的热稳定性。本系统使用的测序级Taq DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶的改良产品，对双链DNA模板的作用非常好，准确性高，条带均匀，背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含一种修饰的核苷酸混合物，如7- deazadgtp (7-deazadgtp，或dITP)代替dgtp，可以消除富含GC区域引起的条带压缩。
退火温度是热循环排序中最重要的因素。高退火温度可以减少模板的二级结构。提高引物-模板配对的严谨性。链退火和模板二级结构限制了小片段PCR产物(:24mer GC含量在50%左右的引物可以得到最好的结果。
与常规测序方法相比，该系统具有以下优点:(1)。该方法中模板DNA的线性扩增产生足够的产物，使银染技术能够检测序列带，测序反应需要0.03 ~ 2 pmol的模板DNA，这取决于模板类型。(2)每个变性循环中的高温可以代替双链DNA(dsDNA)模板的碱变性和乙醇沉淀，变性循环还可以帮助消除线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速再退火带来的问题。(3)高温聚合酶反应削弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶通过高度二级结构区域。
首先，试剂准备
1.银测序DNA测序试剂盒。
2.丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺原液(38%丙烯酰胺W/V，2%亚甲基双丙烯酰胺w/v): 95 g丙烯酰胺，5 g亚甲基双丙烯酰胺溶于140 ml双蒸水，定容至250 ml，经0.45 mm过滤器过滤，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存2周。
3.10%过硫酸铵，将0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中，定容至5 ml，应是新用新用。
4.10×TBE缓冲液(1 mol/L Tris，0.83mol/L硼酸，10 mmol/L EDTA):121.1克Tris，51.35克硼酸。
5.TBE电极缓冲液:将10×TBE缓冲液稀释至1×TBE备用。
6.特梅德
7.固定/停止溶液:2升10%冰醋酸(V/V)备用。
8.染色液:2 g硝酸银和3 ml甲醛，溶于2升超纯水中备用。
9.显影液:将60 g碳酸钠(Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加入3 ml 37% 37%甲醛和40 ml硫代硫酸钠溶液(10 mg/ml)。
10.95%的乙醇。
11.0.5%冰醋酸。
12.西格玛科特(适马猫。#SL-2).
第二，测序反应
1.对于每个测序反应，标记四个0.5毫升eppendorf试管(G、A、T、C)。向每个试管中加入2 ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP混合物)。加入1滴(约20 μl)矿物油，盖上盖子，在冰上或4℃下保存备用。
2.对于每组四个测序反应，在eppendorf试管中混合以下试剂:
(1)样品反应:
质粒模板DNA :2.1 pmol
5倍测序缓冲液:5毫升
底漆:4.5皮摩尔
无菌ddH2O的最终体积为16毫升。
(2)控制反应
PGEM-3Zf(+)对照DNA (4毫克):4.0毫升。
5倍测序缓冲液:5毫升
PUC/M13正向引物(4.5皮摩尔):3.6毫升。
3.向引物/模板混合物中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶(5 μ/ml)(上述步骤2)。用移液管吸几次，混匀。
4.从步骤3中的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml，并将其添加到每个d/ddNTP混合物的试管中。
5.在微型离心机中离心，使所有溶液都在eppendorf管的底部。
6.将反应管放入预热至95℃的热循环仪中，按照中间循环模式启动循环程序。必须为每个引物/模板组合选择最佳退火温度。下面的程序一般可以从引物中读出350个碱基的长度。
7.热循环程序完成后，在每个小管中加入3 μlDNA测序终止溶液，并在微型离心机中旋转以终止反应。
注意
用于(1)测序的模板DNA的量通常根据以下要求添加:
模板类型/长度模板数量
200碱基对(PCR产物):16纳克(120 fmol)
3000~5 000 bp(超螺旋质粒DNA): 4 mg (2 pmol)
48 000碱基对(λ，粘粒DNA): 1毫克(31 fmol)
因为超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，所以用作模板的超螺旋质粒的量比其他模板大。
(2)以下通式可用于计算相当于4.5 pmol的引物的纳克数:
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n为引物碱基数。
以下通式可用于计算相当于1p mol的引物微克数:
dsdna:1 pmol =(6.6×10mg)×n，其中n为模板的底对数。
ss DNA:1 pmol =(3.3×10mg)×n，其中n为模板碱基数。
(3)为了防止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物，热循环仪必须预热到95℃。温度变化应该尽可能快。以下循环时间不包括温度变化时间。如果不确定用哪种模式，建议从模式1开始。
模式1:适用于底漆
95℃2分钟，然后:95℃30秒(变性)，42℃30秒(退火)，70℃1分钟(延伸)。
模式2:适用于GC含量≥24个碱基或略短于50%的引物。
95℃2分钟，然后:95℃30秒(变性)，70℃30秒(退火/延伸)。
(4)加入终止液后，样品可在4℃下过夜。
3.测序凝胶板的制备
1.玻璃板的处理
银染测序的玻璃板必须非常干净。一般先用温水和洗洁精洗，再用去离子水洗去残留的洗洁精，最后用乙醇洗。留在玻璃板上的去污剂微膜可能会在凝胶染色过程中导致高背景(棕色)。凝胶在用粘合剂溶液处理后可以在短玻璃板上化学交联。这一步对于防止银染操作中凝胶撕裂非常重要。
(1)短玻璃板的处理
①将5毫升粘合剂硅烷加入1毫升95%乙醇和0.5%冰醋酸中，制成新的粘合剂溶液。
②用浸有新配制的胶液的脱脂棉纸擦拭仔细清洁并自然干燥的玻璃板，必须擦拭整个板面。
③4 ~ 5分钟后，用95%乙醇单向擦拭玻璃板，再用少许力垂直擦拭。重复此清洁过程三次，每次用干净的纸去除多余的粘合剂溶液。
注意
①用95%的乙醇单向擦拭玻璃板时，用力过猛会带走过多的粘合硅烷，使凝胶粘合不好。
②准备长玻璃板前更换手套，防止硅烷粘连和附着。
③防止胶液污染长玻璃板非常重要，否则凝胶会撕裂。
(2)长玻璃板的处理:
①用浸过Sigmacote溶液的棉纸擦拭干净的长玻璃板。
②5 ~ 10分钟后，用脱脂棉纸擦拭玻璃板，去除多余的Sigmacote溶液。
注意
①可以将用过的凝胶浸泡在水中，用剃须刀片或塑料刮刀刮掉。玻璃板必须用清洁剂彻底清洗。或者在10%NaOH中浸泡后去除凝胶。为了防止交叉污染，用于清洁短玻璃板的工具必须与用于清洁长玻璃板的工具分开。如果发生交叉污染，以后制备的凝胶可能会撕裂或变得松散。
2.凝胶的制备
(1)玻璃板在用粘结硅胶和Sigmacote处理后可以固定。在这种方法中，在玻璃板的左右两侧放置0.2毫米或0.4毫米厚的边条，另一块玻璃板压在上面。将鲨鱼牙的平边插入长玻璃板的一侧，用夹子固定。
(2)根据所需凝胶浓度，按照下表制备测序凝胶。一般6% ~ 8%的凝胶浓度可以获得较好的效果。制备过程中，将尿素用适量双蒸水溶解，然后ACR & amp；Bis和10×TBE缓冲液，然后用双蒸水调节终体积至99.2 ml，用0.45 mm滤膜过滤，再加入过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不需要加热。如果确实需要加热，只有在溶液完全冷却后才能加入TEMED和过硫酸铵。一般在倒胶后4 ~ 6分钟开始聚合。如果聚合不好，应该使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
(3)配好胶后，即可浇注胶板。一般是将凝胶沿分层边缘慢慢倒入玻璃板的凹槽中，倒入后静置使聚合完全。
注意
(1)使用夹具固定玻璃板时，最好使用力度稍大的夹具，防止在灌胶过程中因力度不够而出现漏胶现象。
(2)灌胶过程中应严格防止气泡产生，否则会影响测序结果。
第四，电泳
1.预电泳
(1)凝胶聚合完成后，拔出鲨鱼齿梳子，将梳子倒置，将齿端插入凝胶中，形成加样孔。
(2)立即将凝胶板固定在测序凝胶槽中。通常，测序凝胶槽的上下槽是分开的，因此只有在凝胶板固定后才能加入缓冲液。
(3)将10×TBE的缓冲液稀释至1×TBE，将缓冲液加入上下电泳槽，去除产生的气泡，接通电源，准备预电泳。
(4)有些电泳槽，如LKB的Macrophor，是水浴加热的，所以预电泳前水浴要加热到55℃。有的不使用水浴加热，而是依靠电泳时自身产生的热量，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽。这个槽需要夹两块散热铝板，使整个凝胶板温度一致。
(5)在30 V/cm的电压下预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶中的杂质离子，同时使凝胶板达到要求的温度。高温电泳可以防止富含GC区域形成发夹结构，影响测序结果。
注意
(1)用鲨鱼齿梳制作加样孔时，要注意齿尖要插入胶中0.5mm左右，一定要注意加样孔不能漏，否则得不到正确的结果。
②时刻注意上方电泳槽内的缓冲液是否泄漏，否则容易造成短路，损坏电泳仪器。
2.样品的制备
预电泳时，可制备样品，反应后的样品可在沸水浴中加热1 ~ 3分钟，立即置于冰上。如果样品长期不用，应重新处理。可以使用厚度为0.4 mm的4 ~ 6%聚丙烯酰胺凝胶。厚度小于0.4毫米的胶水可能会导致信号太弱。加样时，不必吸上层覆盖的矿物油，而是小心地吸矿物油下的蓝色样品。
3.样品装载和电泳
关闭电泳仪，用移液管吸取缓冲液清洗样品孔，去除预电泳时扩散的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。加样顺序一般为g、a、t、c，加样后立即进行电泳。刚开始可以30 V/cm进行电泳，5分钟后可以增加到40 ~ 60 v/cm，保持恒压。一般来说，一个长55 cm，厚0.2 mm的凝胶板，在2500 V的恒定电压下电泳2小时就可以到达底部，电泳过程中电流可以从28 mA稳定降到25 mA。为了读取更长的序列，可以使用两轮或多轮加载。
注意
①上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右。如果还没有，你应该等到温度达到。
②一般来说，电泳时不宜使用过高的电压，因为过高的电压会降低凝胶的分辨率，使条带扩散。电泳可以采用恒功率电泳。
测序凝胶的v银染色
染色过程需要将凝胶浸入塑料盘中。因此，使用至少两块尺寸与玻璃板相似的板。在向碗碟中加入新鲜溶液之前，用高质量的水清洗碗碟。
1.电泳后用塑料片小心分开两块板，凝胶要牢牢贴在短玻璃板上。
2.凝胶固定:将凝胶(带玻璃板)放入塑料盘中，浸入固定/终止液中，充分振荡20分钟或直至样品中的染料完全消失。凝胶可以在固定/终止溶液中储存过夜(无振荡)。固定/停止解决方案用于终止显色反应。
3.洗胶:用超纯水洗胶3次，每次2分钟。从水中取出，转入下一个溶液时，握住胶板边缘，静置10 ~ 20秒，使水流出。
4.凝胶染色:将凝胶转移到染色液中，充分摇动30分钟。
5.凝胶发展
向显影液中加入(1)甲醛(3 ml)和硫代硫酸钠溶液(400 μl)以完成显影液的制备。
(2)从染色液中取出凝胶，放入盛有超纯水的盘中浸泡洗涤5-10秒。注意，凝胶从超纯水转移到显影液的总时间不应超过5 ~ 10秒。浸泡太久会导致信号弱或者信号丢失。如果浸泡时间过长，可以重复第五步，用染液浸泡。
(3)立即将凝胶转移到1L(总量的一半)预冷的显色剂中，充分振荡至模板条带开始出现或第一批条带开始出现，将凝胶移入剩余的1L显色剂中继续显色2-3分钟或至所有条带出现。
6.定色胶:直接在显影液中加入等体积的定色/止色液。停止显影反应，修复凝胶。
7.将凝胶在超纯水中浸泡两次，每次2分钟。注意戴上手套，握住胶板边缘，避免在此操作过程中在胶水上印上指纹。
8.在室温下干燥凝胶，或通过抽气和加热干燥凝胶。在可见光盒或明亮的白色和黄色背景(如纸张)上观察凝胶。如果需要永久记录，可以用EDF胶片保存实验结果。
注意
测序产物银染是揭示序列信息的新方法，该系统的成败受多种因素影响。
①水质对染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR或Milli-QR水)或双蒸水可以达到良好的效果。如果水中有杂质，可能不会出现低分子量条带。
②碳酸钠也很重要。最好使用新鲜的、美国化学学会级碳酸钠，如费希尔和柯达ACS试剂级碳酸钠(费希尔目录#S263-500或S262-3，或柯达目录#109-1990)，一般能获得较好的效果。
③上色后的水洗步骤很重要。如果凝胶洗涤时间过长，银颗粒将与DNA分离，导致序列信号很少或没有。如果洗涤时间过长，可以重复染色步骤。
④如果凝胶厚度超过0.4 mm或丙烯酰胺浓度高于4 ~ 6%，则需要延长固色和染色时间。如果凝胶比0.4 mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短到不超过5秒。
⑤除显色反应外，所有步骤均在室温下进行。显影液必须预冷到10 ~ 12℃以降低背景噪声。注:使用前，在显影液中加入甲醛和硫代硫酸钠。使用新配制的染色和显影溶液。不要重复使用任何溶液。
第六，EDF电影发展
使用EDF膜可以增强测序条带的对比度。如果测序凝胶上的条带很浅，我们建议将数据转移到EDF胶片上。银染胶可以增强其图像转移到EDF胶片后条带的可读性。
1.在暗房里，把染好的凝胶(有胶的一面朝上)放在日光灯盒上。如果有合适的扩散器，也可以使用白色灯箱。为了保证曝光时间，用一小块EDF胶片进行不同时间的曝光，检查不同的曝光强度。一般曝光20 ~ 40秒可以得到较好的效果。
2.在红光下找到EDF膜的缺角，然后将膜放在凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF膜是单面的，所以需要保证缝隙在左上角。
3.将一块干净干燥的玻璃板放在EDF膜上，打开灯箱约20秒。
4.通过显影放射自显影胶片来手动显影EDF胶片。可以使用以下操作程序:
(1)在柯达GBX显影剂中显影1 ~ 5分钟；
(2)水洗65438±0分钟；
(3)在柯达GBX定影液中定影3分钟；
(4)水洗1分钟。
注意
①在EDF胶片显影之前，凝胶必须完全干燥。戴手套操作，以免留下指纹。同时需要注意的是，自动洗片机不能用于EDF胶片。
②不同光源的最佳曝光时间可能不同。通过对一小块EDF胶片进行不同时间的曝光，为您使用的光源选择最佳曝光时间。请参考电影手册。
③曝光时间短会使EDF胶片图像更深，曝光时间长有助于弱化背景。“鸟枪”是一种从生物基因组中提取目标基因的方法。首先通过物理方法(如剪切力、超声波等)将生物细胞的染色体DNA在基因水平切割成许多片段。)或酶促化学方法(如限制性内切酶)，然后将这些片段与合适的载体结合，将重组DNA转入受体细菌进行扩增，获得无性繁殖的基因文库。然后，结合筛选方法，从许多转化体菌株中选择含有某种基因的菌株，从中分离和回收重组DNA。
这种方法是通过基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的困难，从基因组DNA文库中筛选目的基因。可以说，这是用“猎枪射击”的原理“击中”了一个基因。由于目标基因在整个基因组中太少太小，相当程度上取决于“运气”，所以人们把这种方法称为“猎枪”或“猎枪”实验。
1.用限制性内切酶切下目的片段的大插入DNA，用琼脂糖凝胶电泳回收。
第二，用物理方法(如超声波等)切掉回收的大片段DNA。)，然后用t 4 DNA聚合酶将DNA的小片段末端磨平。
第三，进行琼脂糖电泳，通过凝胶切割回收1 kbp ~ 2 kbp的DNA小片段。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3’端加一个A碱基。
第四，将添加了A-尾的DNA片段连接到T-载体中，然后转化和克隆。
5.阳性克隆的DNA测序(包括1 kbp ~ 2 kbp插入片段)。
第六，编辑数据，最后连接成一个大的DNA序列。