谁能给我详细讲解一下PCR技术的流程？

简称PCR。聚合酶链反应(PCR)是一种体外酶促合成特定DNA片段的方法，由高温变性、低温退火(复性)和适当的温度延伸等几个反应组成，在一个循环中进行，使目的DNA快速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、省时等特点。它不仅可以用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可以用于疾病诊断或任何有DNA和RNA的地方。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)又称无细胞分子克隆或特定DNA序列的体外引物导向酶促扩增技术。

编辑此段落的简要历史。

人类对核酸的研究已经超过100年。20世纪60年代末70年代初，人们致力于体外基因分离技术的研究。然而，由于核酸含量低，DNA的体外操作受到一定程度的限制。科兰纳在1971年首次提出了体外核酸扩增的思想。但当时基因序列分析的方法还不成熟，对热稳定性强的DNA聚合酶还没有找到，寡核苷酸引物的合成还处于人工和半自动合成阶段。这个想法似乎没有什么实际意义。1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在《科学》杂志上发表了第一篇关于PCR技术的学术论文。此后，PCR技术得到了生命科学界的广泛认可，Kary Mullis从65438到0993年获得了诺贝尔化学奖。但最初的PCR技术相当不成熟，是一种操作复杂、成本高、“无用”的实验室技术。在1988开头，Keohanog通过改进所用的酶来提高扩增的真实性。随后斋祀等人从生活在黄石国家公园温泉中的水生嗜热菌中提取了一种耐热的DNA聚合酶，大大提高了PCR技术的扩增效率。也正是因为这种酶的发现，使得PCR技术得到了广泛的应用，成为遗传和分子生物学分析的根本基石。在随后的几十年中，PCR方法得到了不断的改进:从定性分析方法发展到了定量测定；从原来只能扩增几个kb的基因，到现在可以扩增几十个kb的DNA片段。到目前为止，有十几种PCR技术，例如，将PCR与逆转录酶结合成为逆转录PCR，将PCR与抗体结合成为免疫PCR。

编辑本段的技术原理

DNA的半保守复制是生物进化和传代的重要方式。双链DNA可以在各种酶的作用下变性、熔化成单链，在DNA聚合酶和启动子的参与下，根据碱基互补配对的原理，复制到同一个双分子贻贝中。在聚合酶链反应中

实验中发现，DNA在高温下可以变性熔化，降温时可以复性成双链。因此，可以通过改变温度来控制DNA的变性和复性，设计引物作为启动子，加入DNA聚合酶和dNTP，在体外完成特定基因的复制。但DNA聚合酶在高温下会失活，因此每循环都需要添加新的DNA聚合酶，不仅操作繁琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热的DNA聚合酶- Taq酶是PCR应用中的一个里程碑。该酶可以耐受90℃以上的高温而不丧失活性，这使得PCR技术非常简单，大大降低了成本。PCR技术已经得到广泛应用，并逐渐应用于临床。

编辑本段的工作原理

类似于DNA的自然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由三个基本反应步骤组成:变性-退火(复性)-延伸:①模板DNA的变性:模板DNA加热到94℃左右时的聚合酶链式反应。

之后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增形成的双链DNA被解离，从而可以与引物结合，为下一轮反应做准备；(2)模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA加热变性成单链后，降温至40-60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物延伸:DNA模板-引物偶联物，在DNA聚合酶的作用下，在72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，合成一条与模板DNA链互补的新的半保守复制链，重复循环变性-退火-延伸三个过程，可以得到更多的“半保守复制链”，这条新链可以作为下一个循环的模板。完成一个循环需要2 ~ 4分钟，待扩增的目的基因在2 ~ 3小时内可扩增百万倍。

编辑本段的反应特征

高特异性PCR反应的特异性决定因素是:①引物和模板DNA的特异性正确组合；②碱基配对原理；③Taq DNA聚合酶合成反应的真实性；④目的基因的特异性和保守性。引物和模板的正确组合是关键。引物与模板的结合和引物链的延伸遵循碱基配对的原理。由于聚合酶合成反应的保真性和Taq DNA聚合酶的耐高温性，反应中模板和引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，扩增的目的基因片段可以保持较高的准确性。通过选择特异性高、保守的靶基因区域，其特异性会更高。灵敏度高的PCR产物量呈指数级增加，可将初始待测模板按皮克(pg=10-12)级扩增到μg=10-6的水平。可以从654.38+0万个细胞中检测出一个目标细胞；在病毒检测中，PCR的灵敏度可达3 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中，最低检出率为3个细菌。简单快速的PCR反应使用耐高温的Taq DNA聚合酶。反应液一次性加入后，在DNA扩增液和水浴锅中进行变性-退火-延伸反应，扩增反应一般在2 ~ 4小时内完成。扩增产物一般用电泳分析，不需要同位素，所以没有放射性污染，易于推广。标本纯度低，不需要分离病毒或细菌和培养细胞。粗DNA和RNA可以用作扩增模板。可直接用于血液、体腔液、漱口液、头发、细胞、活组织等临床标本的DNA扩增和检测。

编辑本段的五个元素

参与PCR反应的主要物质有五种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物。引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物和模板DNA之间的互补程度。理论上，只要已知任何模板DNA的序列，就可以根据它设计互补的寡核苷酸链作为引物，通过PCR在体外扩增模板DNA。引物的设计应遵循以下原则:①引物长度:15-30bp，一般在20bp左右。②引物扩增跨度:200-500bp为宜，在一定条件下可扩增到10kb片段。③引物碱基:G+C的含量应在40-60%，G+C过少不利于扩增，G+C过多易产生非特异性条带。ATGC最好随机分布，以避免超过5个嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。(4)避免引物中的二级结构，避免两条引物之间的互补性，尤其是3’端的互补性，否则会形成引物二聚体，产生非特异性扩增带。⑤引物3’端的碱基，尤其是最后一个和倒数第二个碱基要严格匹配，避免末端碱基错配导致PCR失败。⑥引物中存在或可以存在合适的酶切位点，扩增的目的序列最好有合适的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆非常有利。⑦引物特异性:引物应与核酸序列数据库中的其他序列无明显同源性。引物量:每种引物的浓度为0.1 ~ 1 umol或10 ~ 100 pmol，最低的引物量更好产生所需的结果。较高的引物浓度会造成错配和非特异性扩增，增加引物间形成二聚体的机会。

在本段中编辑反应系统和反应条件。

标准PCR反应系统:10×扩增缓冲液10ul四种dNTP混合物，每种混合物含有200 μm ol/L引物10 ~ 100 pmol模板DNA 0.1 ~ 2ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/ L向100 ul中加入双份或三份蒸馏水。PCR反应五要素:参与PCR反应的物质主要有五种，分别是引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(需要Mg2+)。

选择PCR反应条件来编辑这一段

PCR的反应条件是温度、时间和循环次数。温度和时间的设定:基于PCR原理，设定变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中，使用三温点法。双链DNA在90 ~ 95℃变性，然后迅速冷却到40 ~ 60℃。引物退火后与靶序列结合，然后快速加热至70 ~ 75℃。在Taq DNA聚合酶的作用下，引物链沿着模板延伸。对于较短的靶基因(长度为100 ~ 300 BP时)，可采用双温点法，除变性温度外，可结合退火和延伸温度。一般94℃变性，65℃左右退火延伸(在此温度下，Taq DNA酶仍具有较高的催化活性)。①变性温度和时间:变性温度低和熔化不完全是PCR失败的主要原因。一般来说，93℃ ~ 94℃的时间足以使模板DNA变性。如果低于93℃，需要延长时间，但温度不能太高，因为高温环境对酶的活性有影响。如果目标基因模板或PCR产物在这一步不能完全变性，PCR就会失败。②退火(复性)温度和时间:退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后迅速降温至40℃ ~ 60℃，可使引物与模板结合。因为模板DNA比引物复杂得多，所以引物和模板之间碰撞结合的几率比模板互补链之间的几率高得多。退火温度和时间取决于引物的长度、碱基组成和浓度以及靶序列的长度。对于20个核苷酸和50% G+C含量的引物，55℃是选择最佳退火温度的理想起点。引物的复性温度可以通过下式帮助选择合适的温度:Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5 ~ 10℃)在Tm值允许的范围内，选择较高的复性温度可以大大降低引物与模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30 ~ 60秒，足以使引物和模板完全结合。③延伸温度和时间:Taq DNA聚合酶生物活性:70 ~ 80℃ 150核苷酸/秒/酶分子70℃ 60核苷酸/秒/酶分子55℃ 24核苷酸/秒/酶分子90℃以上，DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般为70 ~ 75℃，常见温度为72℃。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间取决于待扩增片段的长度。一般对于1Kb以内的DNA片段，1min的延伸时间就足够了。3 ~ 4 KB的靶序列耗时3 ~ 4min；10Kb的扩增需要延伸到15min。过长的延伸会导致非特异性扩增带的出现。对于低浓度模板的扩增，延伸时间稍长。

编辑该酶及其浓度。

目前可用的Taq DNA聚合酶有两种，一种是从水热芽孢杆菌中纯化的天然酶，另一种是大肠杆菌合成的基因工程酶。催化一个典型的PCR反应大约需要2.5U的酶(当总反应体积为100ul时)。浓度过高会引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量和浓度与dNTP的质量和浓度以及PCR扩增的效率密切相关。dNTP粉末是颗粒状的，如果保存不当很容易失去生物活性。DNTP溶液呈酸性，应在高浓度后用1M NaOH或1M Tris配制。将HCL缓冲液的PH值调至7.0 ~ 7.5，少量分装，冷冻于-20℃。反复冻融会降解dNTP。在PCR反应中，dNTP应在50 ~ 200 μm ol/L，特别是四种dNTP的浓度应相等(等摩尔配制)。如果其中任何一个和其他的不一样(更高或更低)，就会造成不匹配。过低的浓度会降低PCR产物的产量。DNTP能与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度。模板(靶基因)核酸模板核酸的数量和纯化程度是PCR成败的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常使用SDS和蛋白酶K来消化和处理样品。SDS的主要作用是:溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，从而溶解膜蛋白破坏细胞膜，游离细胞内的核蛋白。SDS也能与蛋白质结合沉淀；蛋白酶K能水解和消化蛋白质，尤其是与DNA结合的组蛋白，然后用有机溶剂苯酚和氯仿提取蛋白质和其他细胞成分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸可以用作PCR反应的模板。在一般的临床样本中，可以用一种快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化染色体的蛋白质，使目的基因游离出来，直接用于PCR扩增。RNA模板的提取通常采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，防止RNA酶降解RNA。Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著影响。在一般的PCR反应中，当各种dNTP的浓度为200 μm ol/L时，Mg2+的适宜浓度为1.5 ~ 2.0 mmol/L..Mg2+浓度过高，反应的特异性会降低，出现非特异性扩增。浓度过低，Taq DNA聚合酶的活性会降低，反应产物也会减少。

编辑此工作步骤。

PCR反应的基本过程

标准的PCR过程分为三步(如图):1。DNA变性(90℃-96℃):在热的作用下，双链DNA模板的氢键断裂，形成单链DNA；2.退火(复性)(40℃-65℃):系统温度降低，引物与DNA模板结合形成局部双链。3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶的作用下(最好的活性在72℃左右)，以dNTP为原料，从引物的5’端延伸到3’端，合成一条与模板互补的DNA链。在每个循环中的变性、退火和延伸之后，DNA含量加倍。目前有些PCR由于扩增区域很短，即使Taq酶活性不是最适，也能在短时间内复制，因此可以改为两步法，即退火和延伸在60℃-65℃同时进行，以减少一次加热和冷却过程，提高反应速度。

编辑此段落的循环参数。

1，初始变性。模板DNA的完全变性对PCR的成功至关重要，通常在95℃加热3-5分钟。2.引物退火的退火温度一般由实验(经验)决定。退火温度对PCR的特异性有很大影响。3.引物延伸引物延伸一般在72℃(Taq酶的最适温度)进行。延伸时间取决于扩增片段的长度和所用Taq酶的扩增效率。4.循环中的变性步骤:一般95℃30秒就足以使循环中的各种靶DNA序列完全变性:变性时间过长会破坏酶的活性，过短时靶序列没有完全变性，容易造成扩增失败。5、循环数大多数PCR包含25-35个循环，容易产生非特异性扩增。6.最后，最后一个循环后，在72℃下维持反应5-15分钟，使引物完全延伸，单链产物退火成双链。PCR-PCR常见问题

编辑该电泳检测时间。

一般是48小时以内，有些比当天电泳检测要好。超过48小时后，带型不规则，甚至消失。无扩增带的假阴性PCR反应的关键环节是①模板核酸的制备，②引物的质量和特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。要找到原因，也要对以上环节进行分析研究。模板:①模板中含有蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中的蛋白质未被消除，尤其是染色体中的组蛋白，④模板的提取和制备过程中丢失过多，或吸入苯酚。⑤模板核酸没有完全变性。当酶和引物的质量良好时，没有扩增带，这很可能是由于样品的消化和模板核酸提取过程的失败。所以为了配制有效稳定的消化液，程序要固定，不能随意更改。酶失活:需更换新酶或新旧酶同时使用，分析假阴性是否因酶活性丧失或不足所致。需要注意的是，Taq酶或溴化乙锭有时会被遗忘。引物:引物的质量、引物的浓度、两个引物的浓度是否对称是PCR失败或扩增带不理想的常见原因，容易分散。部分批次的引物合成质量存在问题。两个引物中的一个浓度高，另一个浓度低，导致不对称扩增效率低。对策如下:①选择好的引物合成单个位置。②引物的浓度不仅取决于OD值，还取决于引物原液的琼脂糖凝胶电泳。一定要有引物带，两条引物带的亮度要大致相同。比如一个引物有带，另一个引物没有带，此时PCR可能会失败，要和引物合成单位协商解决。如果一种底漆亮度高，另一种亮度低，稀释底漆时浓度要平衡。(3)引物应高浓度小包装保存，避免引物因反复冻融或长期存放在冰箱中而变质降解。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体。Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率有很大影响。浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则会影响PCR扩增的产量，甚至使PCR扩增失败而不产生扩增带。反应体积的变化:通常，用于PCR扩增的体积为20ul、30ul和50ul。或者100ul，PCR扩增要用哪个体积是根据科研和临床检测的不同目的来设定的。做小体积的时候，比如20ul，一定要设置好模式条件，否则很容易失败。

编辑本段的物理原因。

变性对PCR扩增很重要，如变性温度低、变性时间短，极易出现假阴性；过低的退火温度会导致非特异性扩增，降低特异性扩增效率。过高的退火温度会影响引物和模板的结合，降低PCR扩增效率。有时需要用标准的温度计来检测扩增器或水溶锅中的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列的变异:如果靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板的特异性结合，或者由于靶序列的某一段缺失导致引物与模板失去互补序列，其PCR扩增就不会成功。假阳性PCR扩增条带与靶序列条带一致，有时条带更整齐、更亮。引物设计不当:选择的扩增序列与非靶扩增序列具有同源性，因此在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物是非靶序列。如果靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。引物需要重新设计。靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两个原因:一是全基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。这种假阳性可以通过以下方法解决:操作要小心轻柔，防止靶序列被吸入装填枪或溅出离心管。除酶和不能耐高温的物质外，所有试剂或设备都要高压灭菌。使用的离心管和进样枪头应一次性使用。必要时，在添加样品之前，用紫外线照射反应管和试剂以破坏存在的核酸。二是空气中核酸小片段的污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。它们可以相互拼接，与引物互补后，PCR产物可以扩增，产生假阳性，通过巢式PCR可以减轻或消除。出现非特异性扩增带。PCR扩增后的条带与预期大小不一致，或大或小，或特异性扩增条带和非特异性扩增条带同时出现。出现非特异性条带的原因有两个:一是引物与靶序列不完全互补，或者引物聚合形成二聚体。第二，Mg2+离子浓度过高和退火温度过低与PCR循环次数过多有关。其次是酶的质量和数量，往往某些来源的某些酶容易出现非特异性条带而另一些则不会，有时酶量过高会出现非特异性扩增。对策是:必要时重新设计指南。减少酶的用量或从其他来源更换酶。减少引物的用量，适当增加模板的用量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用双温点法(93℃变性，65℃左右退火延伸)。PCR扩增有片曳或涂抹带，有时出现涂抹带或片带或地毯样带。原因往往是酶太多或酶质量差，dNTP浓度太高，Mg2+浓度太高，退火温度太低，循环次数太多。对策是:减少酶的用量，或者换其他来源的酶。②降低dNTP浓度。适当降低Mg2+的浓度。增加模板数量，减少循环次数。

编辑这个克隆的PCR产物。

1)克隆PCR产物的最佳条件是什么？最佳的插入片段:载体比例需要通过实验来确定。1: 1(插入:向量)往往是最佳比例，1: 8或8: 1的摩尔比也是可以接受的。应确定比率范围。连接用5ul 2X连接酶，50ng质粒DNA，1Weiss T4连接酶，插入片段为10ul。保持温度在室温65438±0小时，或在4℃过夜。在这两个温度下，缺乏T- projection的载体会自我连接，产生蓝点。在室温下保持温度1小时可以满足大部分克隆要求。为了提高连接效率，需要在4℃过夜。2)2)PCR产物需要凝胶纯化吗？比如凝胶分析只有一条带，不需要凝胶纯化。如果还能看到其他条带，可能是二聚体积累了大量引物。少量的引物二聚体也具有高摩尔数，这将产生高比例的具有引物二聚体的克隆，而不是目标插入片段。所以克隆前需要凝胶纯化。3)如果没有回收到目标片段，需要做什么对照实验？a)包被未转化的感受态细胞。如果有菌落，说明氨苄青霉素无效，或者有氨苄青霉素抗性的质粒被污染，或者产生了氨苄青霉素抗性的菌落。b)转化完整质粒，计算菌落生长数，并确定转化效率。例如稀释1ug/ul质粒1:100，用1ul转化100ul感受态细胞。用SOC稀释到1000ul后，在板材上铺100ul。过夜培养后，产生了1000个菌落。转化率为:产生的菌落总数DNA扩散总数。铺板DNA的总量是转化反应中使用的量除以稀释倍数。具体是用10ng DNA进行转化，用SOC稀释到1000u后，含有10 ng DNA，用1/10铺展，共享1 ng DNA。转化率为:1000个克隆x 10(立方)ng/铺板1 ng DNA ug = 10(立方)cfu/ ug转化pGEM-T应用10(立方)cfu/ ug感受态细胞，若无集落或集落少，则易感细胞易感。c)使用pGEM-T阳性对照或PCR产物产生>:20-40个蓝点(使用指定的step 10(8次方)cfu/ ug感受态细胞)，表明载体丢失了T..可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801，M1804，M1794)质量标准好，无核酸酶污染，其他来源的T4 DNA连接酶不宜替代。d)用pGEM-T或pGEM-T Easy vector转化高频感受态细胞(10(8次方)cfu/ug)，按照规定的实验步骤，可获得100个菌落，其中60%应为白色斑点，如>:20-40个蓝色斑点，无菌落或很少菌落，连接问题。4)对照实验的结果是好的，但是没有回收到目标片段。实验有什么问题？a)连接在室温下保持65438±0小时，可以满足大部分克隆。为了提高效率，需要在4℃过夜。b)插入的片段被污染，导致3’-T的缺失，或连接和转化的抑制。因此，将插入的片段与pGEM-T阳性对照混合，然后连接。如果对照的菌落数减少，插入的片段需要纯化或重新制备。如果产生大量蓝点，说明插入的片段被核酸酶污染，使pGEM-T或pGEM-T易载体3′-T缺失。c)插入片段不适合连接。由于过度的紫外线照射，有时会出现凝胶纯化的插入物。过多的紫外线照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必须再次纯化。d)具有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端没有A，这是克隆pGEM-T或pGEM-T Easy载体所需要的。加入Taq DNA聚合酶和核苷酸可以在末尾加一个。详情请参考pGEM-T pGEM-T Easy carrier (TM042)的技术数据。e)高度重复的序列可能不稳定，导致扩增过程中的缺失和重排。如果发现插入经常被删除和重排，应使用重组缺陷型大肠杆菌菌株，如SURE细胞。

编辑此PCR反应的分类。

重叠PCR

重叠扩增基因拼接法是一种基于普通PCR技术的基因融合和定点突变的有效方法。众所周知，引物只需要与模板有效结合即可，尤其是5’端序列不需要与模板完全配对，因此可以在扩增引物的5’端添加一个甚至两个限制性位点，以便后期克隆。SOEing方法正是利用了这一特性，将新序列混合到两个独立的基因中，达到两个基因之间存在重叠区域的目的，3’端的结合使得基因融合或定点突变成为可能。

逆转录聚合酶链反应

RT-PCR是逆转录PCR和实时PCR的通用缩写。逆转录-PCR (RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛使用的变体。在RT-PCR中，RNA链被逆转录成互补的DNA，然后被用作PCR扩增DNA的模板。