两项或多项发明申请一项专利的一般发明概念的例子。
权利主张文件
1，对痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152的O-抗原具有特异性的核苷酸，其特征在于
因此，它是如SEQ ID NO: 1所示的分离的核苷酸，总长度为12235个碱基。
2.根据权利要求1的痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152的O-抗原。
核苷酸的特点是由10个基因组成，这些基因都位于galF基因和gnd基因之间。
3.根据权利要求2的对痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核。
苷酸，其特征在于该基因是:
与运输和加工相关的基因包括wzx基因或与wzx功能相似的基因、wzy基因或与WZX相关的基因。
Wzy有功能相似的基因；
糖基转移酶基因，包括orf5、orf7、orf9和orf10基因；其中该基因:
Orf5是SEQ ID NO: 1中4626至5663个碱基的核苷酸；
Wzx是SEQ ID NO: 1中具有5663至6874个碱基的核苷酸；
Orf7是SEQ ID NO: 1中第6877至7869位碱基的核苷酸；
Wzy是SEQ ID NO: 1中7882至8955个碱基的核苷酸；
Orf9是SEQ ID NO: 1中具有8960至9721个碱基的核苷酸；
Orf10是SEQ ID NO: 1中9718至10788碱基的核苷酸。
4.根据权利要求1-2的对痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152特异的O-抗原。
核苷酸的特征在于其来源于wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf5、orf7、
Orf9和orf10基因；或糖合成途径基因中的寡核苷酸；和它们的混合物或它们的组合。
5.根据权利要求4的对痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核。
苷酸，其特征在于寡核苷酸是:
源自orf5的寡核苷酸对:
seq id no:1中的4866-4886个核苷酸和5573-5591个核苷酸，
SEQ ID NO: 1中5156至5176的核苷酸和5587至5595的核苷酸，
Seq id no: 4641至4660个核苷酸和1中的5302至5320个核苷酸；
衍生自wzx的寡核苷酸对:
Seq id no: 189至6207个核苷酸和1中的6731至6750个核苷酸，
Seq id no: 5713至5733个核苷酸和1中6724至6741个核苷酸，
Seq id no: 6463至6481个核苷酸和1中的6821至6839个核苷酸；
源自orf7的寡核苷酸对:
SEQ ID NO: 1中的7024至7041个核苷酸和7779至7800个核苷酸，
SEQ ID NO: 1中第6972-6992位碱基的核苷酸和第7578-7596位碱基的核苷酸，
SEQ ID号:7131至7148碱基的核苷酸和1中7693至7674碱基的核苷酸；
来自wzy的寡核苷酸对:
seq id no:1中的7883-7903核苷酸和8903-8921核苷酸，
SEQ ID NO: 1中第8049-8069位碱基的核苷酸和第8876-8894位碱基的核苷酸，
Seq id no: 197至8214个碱基核苷酸和8197至8214个碱基核苷酸；
源自orf9的寡核苷酸对:
SEQ ID NO: 1中9020至9040个碱基的核苷酸和9630至9647个碱基的核苷酸，
SEQ ID NO: 1中第8982-9000位碱基的核苷酸和第9443-9462位碱基的核苷酸，
Seq id no: 9165至9183碱基核苷酸和1中9525至9543碱基核苷酸；
源自orf10的寡核苷酸对:
Seq id no: 9752-9770核苷酸和10567-10586核苷酸在1，
SEQ ID NO: 1中9165至9183的核苷酸和9525至9543的核苷酸，
Seq id no: 9934-9952核苷酸和10513-10530核苷酸中的1。
6.根据权利要求1的对痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核苷酸。
体外检测表达O-抗原细菌的应用。
7.根据权利要求1，对痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152的O-抗原具有特异性的核。
糖苷酸的应用特征在于用作PCR的引物，用作杂交反应、荧光检测和制造的探针。
基因芯片或微阵列用于体外检测痢疾志贺氏菌12或大肠杆菌O152。
8.根据权利要求1的对痢疾志贺氏菌12和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核苷酸。
该分离方法的特征在于包括以下步骤:
1)基因组提取。
志贺氏菌在LB培养基中37℃培养过夜，离心收集细胞。使用pH值为8.0的Tris-HCl。
然后在37℃孵育20min，加入溶菌酶分解细菌，加入蛋白酶K和SDS降解虫卵。
白质，然后加入核糖核酸酶去除RNA；加入等体积的苯酚提取混合物，取上清液，用等体积的苯酚∶氯仿:
异戊醇萃取两次以除去酶和蛋白质，然后用等体积的乙醚萃取残留的苯酚。用二倍体乘以b
用酒精沉淀DNA，用玻璃纤维辊出DNA，用70%乙醇洗涤DNA，最后用30μlTE重悬DNA。
0.4%琼脂糖凝胶电泳检测A组DNA。
2)长PCR扩增痢疾志贺氏菌12型O-抗原基因簇。
首先，根据O-抗原基因簇启动子区常见的跳跃启动序列设计上游引物ATT。
GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT，然后根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物。
-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C；使用勃林格曼海姆的扩展长
模板PCR扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序为:94℃预变性2分钟；然后
94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，如此循环30次；最后，在68
在℃继续延伸7分钟，获得PCR产物；合并6管长PCR产物，使用Promega公司的Wizard
PCR产物用PCR Preps纯化试剂盒纯化；
3)O-抗原基因簇文库的构建
O-抗原基因簇文库构建采用改良Novagen DNaseI鸟枪法，反应体系为300ng。
PCR纯化产物，0.9μl 0.1M MnCl2，1 μ l 1: 2000稀释DNaseI，室温反应。
执行；酶消化10分钟使消化的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，然后加入2μl 0.1m EDTA。
终止反应，合并四管相同的反应体系，用等体积的苯酚萃取一次，用等体积的苯酚∶氯仿萃取一次；
将异丙醇混合溶液萃取一次，其中苯酚∶氯仿∶异戊醇混合体积比为25∶24∶1；然后使用相同的音量
乙醚提取一次后，用2.5倍的无水乙醇沉淀DNA，用70%乙醇洗涤，最后重悬于
18μl水；随后，向该混合物中加入2.5μl DNTP，该混合物含有1mMdCTP、1mMdGTP和1mMdTTP。
以及10mMdATP、1.25 μ l 100 MMD DTT和5单位T4DNA聚合酶，产物0℃消化30分钟。
在75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其缓冲液。
将系统扩增至80μl，在DNA的3’端添加dA尾。将混合物与氯仿混合
异戊醇混合溶液萃取和乙醚萃取，然后与pGEM-T-Easy载体在65438±06℃下连接24小时，总体积为
90μl，包括25单位T4DNA连接酶和9μl含10倍T4DNA连接酶的缓冲液，最后1/10。
用体积为pH = 5.2的3M NaAc和两倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，用70%乙醇洗涤，然后溶于30μl
在水中获得连接产物，通过Bio-Rad公司的电转化制备感受态细胞的方法制备感受态大肠杆。
菌株DH5α细胞，取2-3μl连接产物和50μl感受态大肠杆菌DH5α，然后转移至Bio-Rad。
公司0.2cm电击杯电击，电压2.5 kV，时间5.0毫秒到6.0毫秒。电击之后，
向杯中加入1ml SOC培养基使细菌复活，然后用氨苄青霉素、X-Gal和IPTG包被细菌。
在LB固体培养基上37℃培养过夜，第二天获得蓝色和白色菌落。转化获得的白色菌落，即白色克隆。
在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时，从每个克隆中提取质粒并用EcoRI消化。
鉴定插入片段的大小，获得的白色克隆群构成痢疾志贺氏菌12型的O-抗原基因。
集群库；
4)获得O-抗原基因簇的全序列
从上海生物工程公司生产的O-抗原基因库中筛选出120个插入片段在700bp以上的克隆。
有限公司用ABI377 DNA自动测序仪对克隆中插入的片段进行单向测序，使测序达到80%。
根据获得的序列设计剩余20%的序列，然后从痢疾志贺氏菌12型的碱基设计引物
通过DNA中的直接PCR和对PCR产物的测序，获得O-抗原基因簇的所有序列，并且所有序列均使用英国sword获得
桥梁医学研究委员会分子生物学实验室出版的Staden package软件包Pregap4。
用Gap4软件拼接编辑所有序列，得到痢疾志贺菌12型O-抗原基因簇核心。
全长核苷酸序列的质量主要通过两个方面来保证:(1)每个基因组六个长PCR。
反应，然后混合这些产物以生成库；(2)对于每个基地，保证3个以上基地的高质量覆盖；
5)获得O-抗原基因簇的结构
用国家生物技术信息中心的orffinder发现痢疾志贺氏菌
在12株blast的O-抗原基因簇的核苷酸序列中发现该基因，并发现10个开放阅读框。
该软件与GenBank中的基因进行比较，找到这些开放阅读框的功能并确定它们是什么基因，然后
基因注释由英国sanger中心的Artemis软件完成，DNA和蛋白质测序由ClustTralw软件完成。
通过柱间精确比对，最终得到痢疾志贺菌12型O-抗原基因簇的结构。