关于双荧光素酶的注记
答:单报告基因的实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因通过转染* * * "对照"为实验提供基线，从而最大限度地减少细胞活性、转染效率等外界因素对实验的影响，使数据结果更可信。
答:双荧光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。它们没有种源同源性，对应不同的反应底物，所以不存在交叉干扰。由于超强的光信号和超高的信噪比，该系统被广泛用于miRNA靶基因验证。MiRNA主要作用于目的基因的3’UTR，目的基因的3’UTR区可以构建在载体中报告基因荧光素酶的后面。通过比较miRNA的过表达或干扰，报告基因表达的变化(监测荧光素酶活性的变化)可以定量反映miRNA对靶基因的抑制作用，即荧光值可以用来判断miRNA是否与靶基因结合。
答:目的基因的3’UTR长度不同，因此将全长插入载体是不切实际的。通常只插入包括miRNA结合位点在内的200bp左右的序列，大概是400bp[1]，但也有文献插入80 bp[2]，也有文献选择200bp以上[3]，但严格来说应该选择400bp。
答:常用的运营商有两种策略。第一是两种荧光素酶分别位于两个载体上，第二是两种荧光素酶位于同一载体上。以第一种为例，这两种载体分别是pMIR-REPORT miRNA载体和pRL-TK载体。经过检索，发现pMIR-REPORT miRNA载体由Ambion公司开发，用于克隆插入miRNA靶序列的载体，评估miRNA在细胞中的功能。这个向量的映射如下:
另一种载体是pRL-TK载体，由Promega开发。pRL-TK是海肾荧光素酶的报道载体，含有SV40增强子。质粒图谱如下:
从这两张图谱可以发现，载体pMIR-REPORT miRNA主要用于评价miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因3’UTR放在荧光素酶后面，是萤火虫荧光素酶，而载体pRL-TK表达海肾荧光素酶。当这两个质粒* * *共转染293细胞检测荧光时，pRL-TK。
第二种方案是将萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶构建成载体，这样偏差更小。毕竟转染一个质粒比转染两个质粒容易。这方面，根据检索到的资料，现在比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒，图谱如下:
另一个质粒是国产的，就是多能基因的pEZX-MT06质粒。地图如下:
答:首先要知道，插入到目的基因原来3’UTR的质粒称为野生型质粒。此外，我们需要在萤火虫荧光素酶的3’UTR中插入一个带有miRNA结合位点突变的序列载体。这种质粒通常被称为突变质粒。最后，还有各种控制载体，包括萤火虫荧光素酶空载体、miRNA空载体和肾素荧光载体。如文献中的案例[4]所示，本文使用。
注:pGL3为荧光素酶报告质粒，绿色为对照组，即无miRNA质粒，红色为有miRNA质粒的正常组。思路是荧光素酶质粒(三种情况:①空质粒；②添加了WT目的基因3’UTR的质粒；③带有MUT靶基因3’UTR的质粒)×miRNA前体(有或无MUT两种情况)，排列组合成六组，具体如下:
第一组荧光素酶质粒pGL3不添加3’UTR片段+miRNA载体质粒。
第二组荧光素酶质粒pGL3不添加3’UTR片段+miR-200c质粒。
第三组荧光素酶质粒pgl 3-WT-3’UTR ++ miRNA载体质粒
第四组集中于荧光素酶质粒pgl 3-WT3’UTR+miR-200 c。
第五组荧光素酶质粒pgl 3-mut-3’UTR+mirna载体质粒。
第六组集中于荧光素酶质粒pgl 3-mut-3’UTR+mir-200 c。
理想结果:第四组下降，即miRNA能与目的基因的3UTR结合，而第六组不变，即突变后目的基因的3’UTR不与miRNA结合。
答:最经典的仪器是Promega的GloMax 20/20发光检测仪，但是这个仪器一次只适合检测一种brew。但也可以用多功能酶标仪检测(我们实验室的仪器是VARIOSKAN LUX)，可以实现多通量检测。萤火虫荧光素酶产生的光为黄绿色，波长为550-570nm；然而，海肾萤光素酶产生波长为480纳米的蓝光。
答:测量结果显示萤火虫荧光素酶产生的光信号记录为RL1，海肾荧光素酶产生的信号记录为RL2。数据经过RL1/RL2均质化后，可以用ANOVA进行每两组之间的检测。