DDRT-PCR的发展历史

随着PCR技术的发展，建立了一系列基于基因分离的新技术和新方法。如mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)，以及进一步改进的代表性差异分析(RAD)、抑制性消减杂交(SSH)和交叉消减RNA差异显示技术(RSDD)。

差异显示PCR是基于大多数真核生物mRNA 3’端的多聚腺苷酸化尾(polyA)结构，因此可以用含有oligo(dT)的寡核苷酸作为引物，将不同的mRNA逆转录成cDNA。该方法的创始人梁P和PardeeA根据Poly A序列前两个碱基除AA外只有12种可能性的特点，设计合成了12个下游引物，称为3’-锚定引物，通式为5’-t 11Mn；同时，为了扩增polyA上游500 bp内所有可能的mRNA序列，在5’端设计了20个长度为10 bp的随机引物。如此构建的引物对通过PCR扩增可产生约20，000条DNA条带，每条条带代表一种特定的mRNA类型，通常覆盖了在某一发育阶段某一细胞类型中表达的所有mRNA。回收不同组织特有的差异表达条带中的DNA，扩增至所需含量，然后进行Southern印迹或Southern印迹或直接测序，对差异表达条带进行鉴定分析，最终获得差异表达的目的基因。

与差异筛选和消减杂交相比，mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)具有许多优点:①快速、易操作；②由于PCR扩增技术的应用，可以高灵敏度地鉴定低丰度的mRNA③可以同时比较两个或两个以上不同来源的mRNA样本的基因表达差异。

虽然差异显示技术有很多优点，但在实际操作中仍存在一些问题，主要表现为:①差异条带过多，假阳性率高达70%，重复性差，有强烈的高拷贝数mRNA倾向；②扩增带的分子长度较短，一般在110-450bp之间。