科学|科学家发现可能阻止帕金森病恶化的新目标。
2018 165438+10月2日，美国约翰·霍普金斯大学医学院神经退行性疾病和干细胞研究中心的Valina L. Dawson和Ted M. Dawson团队在《科学》杂志上发表了一篇题为聚(ADP-核糖)的论文。在《驱动帕金森病病理性α-突触核蛋白神经变性》的研究论文中，发现聚(ADP-核糖)可增强α-突触核蛋白毒性，促进α-突触核蛋白聚集，参与病理性α-突触核蛋白介导的细胞损伤，从而促进PD的进展。这一发现可能为预防PD的进展提供一个治疗靶点[1]。《科学》杂志也发表了一篇关于这一研究成果的综述文章[2]。
你觉得有什么分子看着眼熟吗？对了，聚(ADP-核糖)是PAR，上一篇文章也提到了。
现在我们一起来学习这篇文章。
帕金森病和α-突触核蛋白
帕金森病是一种进行性神经退行性疾病。患者主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、体位性步态障碍四大运动症状，部分伴有焦虑、抑郁、睡眠障碍、自主神经功能障碍、认知障碍等非运动症状。
帕金森病的主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元减少，残存的神经元胞质即路易体出现嗜酸性包涵体。纤维状αα-突触核蛋白(α-syn)是路易体的主要成分。
α-syn是一种广泛表达于脑内的突触前蛋白，在生理状态下以可溶性蛋白单体的形式存在。当它聚集成不溶性纤维寡聚体时，它是致病性的并能引起神经元细胞死亡。病理性α-syn可以像朊病毒一样在细胞间传播，促进PD的进展。
然而，是什么导致了α-syn的病理性聚集呢α-syn的病理性聚集是如何导致细胞死亡的呢？这些都不清楚。
PAR和PARP1
聚ADP核糖(PAR)是聚ADP核糖聚合酶-1 (PARP-1)以NAD+为底物合成的产物。PARP-1和PAR的主要作用是发现各种原因引起的DNA损伤，启动相应的DNA修复机制。
PARP-1依赖性细胞死亡
PARP-1依赖性细胞死亡(Parthanatos)是一种由PARP-1激活引起的程序性细胞坏死。Parthanatos以PAR(PARP-1的酶产物)+“thanatos(希腊死神)命名。
部分死亡是细胞死亡的一种形式，广泛存在于神经系统疾病、心脏病和其他疾病中。
由于Parthanatos中PARP-1和PAR可引起细胞死亡，作者拟探讨PARP-1和PAR是否参与PD中病理性α-syn引起的DA神经元丢失。
1?α-syn？PFF的神经毒性依赖于PARP-1。
α-syn预成纤维(α-syn PFF)是一种体外重组α-syn，在体内可以聚集成类似α-syn的纤维，并像朊病毒一样在神经元细胞间传播。将其注射到小鼠脑内，其S129位点可磷酸化形成p-α-syn。
为了探讨α-syn PFF能否激活PARP-1，用α-syn PFF处理大鼠原代皮层神经元，用WB检测PAR的变化。结果发现，PAR的表达从第3天到第7天逐渐增加，直到第14d达到高峰。
PI染色显示PAR的增加伴随着细胞死亡的增加。
用三种PARP抑制剂(ABT-888，AG-014699，BMN 673)处理细胞，发现它们能阻止α-syn PFF诱导的细胞活化和细胞死亡。
经α-syn PFF处理的细胞可促进α-syn在S129位点磷酸化形成p-α-syn，促进水溶性α-syn形成不溶性α-syn，这两者都是病理性α-syn的特征。PARP抑制剂可以明显阻止这些效应。
敲低或敲除PARP-1也能显著阻止α-syn PFF诱导的PARP活化和凋亡。
敲除PARP-1可以阻止α-syn PFF诱导的α-syn磷酸化和不溶性α-syn的形成
广谱胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD可以部分缓解α-syn PFF的毒性，坏死性凋亡抑制剂Nec-1和自噬抑制剂3-MA不能缓解α-syn PFF诱导的细胞死亡，而PARP抑制剂ABT-888可以阻止α-syn PFF诱导的细胞死亡，说明α-syn PFF诱导的细胞死亡主要依赖于PARP-65438。
上述实验结果表明，敲除PARP-1或用药物抑制PARP-1可减少p-α-syn的形成。这种减少可能是由于细胞吞噬的α-syn PFF减少吗？
在PARP-1敲除和药物抑制条件下，检测胞吞作用中生物素标记的α-syn PFF含量，与对照组无显著差异，说明PARP-1不影响细胞对α-syn PFF的摄取。
背景中提到α-syn PFF可以像朊病毒一样在细胞间传播，促进PD的进展。它的细胞间传播特性是否也依赖于PARP-1？
作者进行了微流体室实验。首先通过微流控装置将α-syn PFF加入1 (C1)室，在14d上检测α-syn是否出现在2室(C2)和3室(C3)，即α-syn PFF是否具有传播功能。
结果表明，在WT神经元组的C2和C3 14d处可检测到p-α-syn，而在PARP-1 KO组中未检测到，表明α-syn PFF的传播功能也依赖于PARP-1。
2?α-syn PFF通过NO诱导的DNA损伤激活PARP-1
第一部分已经证明α-顺式PFF可以激活PARP-1，并通过PARP-1发挥其神经毒性，那么α-顺式PFF是如何激活PARP-1的呢？
作者发现，用α-syn PFF处理神经元或将其直接注射到小鼠的大脑中，可以增加NO和DNA损伤的水平。
用NO合酶抑制剂L-NAME处理神经元细胞或小鼠脑，可抑制α-syn PFF诱导的NO合成、DNA损伤和PARP-1激活。
此外，一氧化氮合酶抑制剂还能抑制α-PFF诱导的细胞死亡。
这些结果表明，α-syn PFF通过激活NO合酶，激活PARP-1引起DNA损伤，并通过部分氧化引起细胞死亡。
3?α-syn？PFF通过PAR介导多巴胺神经元丢失。
已有研究证明α-syn PFF通过parthanatos引起细胞死亡，那么这一通路是否会与PD中DA神经元的丢失有关？
向小鼠纹状体内注射α-syn PFF可激活PARP-1，使PAR水平升高。敲除PARP-1或用PARP-1抑制剂处理，可阻止α-syn PFF引起的PAR水平升高，降低α-syn PFF的神经毒性。
同时，注射α-syn pff 6个月后，WT小鼠注射侧DA神经元减少约50%，而PARP-1敲除组和PARP-1抑制剂处理组DA神经元减少不明显。
酪氨酸羟化酶(TH)是DA合成的关键酶。作者发现，用α-syn PFF处理WT小鼠后，TH和DA转运蛋白(DAT)的水平显著降低，但敲除或抑制PARP-1可以防止这种现象。
此外，α-syn PFF处理的WT小鼠纹状体DA和DA代谢产物含量显著降低，而PARP-1 KO组和PARP-1抑制剂组无显著变化。
向WT小鼠脑内注射α-syn PFF可延长小鼠的爬杆时间，降低握力强度。敲除PARP-1或PARP-1抑制剂可以缓解α-syn PFF引起的PD运动症状。
4?PAR促进α-syn纤维化。
之前的研究表明PAR可以导致固有的无序蛋白液分层并引起其聚集，那么PAR是否可以促进α-syn聚集呢？
在有或没有PAR的情况下，作者观察到α-syn单体孵育一段时间后聚合物的形成。发现在没有PAR的情况下孵育72小时后出现不同分子量的α-syn聚合物，而在有PAR的情况下孵育24小时后出现不同分子量的α-syn聚合物。
不同的孵育温度或不同浓度的PAR会导致α-syn的纤维化效率不同(原图S7A-C)。
T(硫黄素T荧光，ThT)可用于定性和定量监测淀粉样纤维的聚集过程。通过ThT荧光监测，可以看出PAR对α-syn聚集有明显的促进作用。
透射电镜观察到α-syn单体在无PAR的情况下孵育72h后出现α-syn寡聚物纤维，而在有PAR的情况下孵育12h后可见α-syn寡聚物的形成。
由于PAR是一种带高度负电荷的分子，为了排除PAR引起的α-syn聚集是由于蛋白质之间的电荷相互作用，作者研究了带相同负电荷的PolyA分子对α-syn聚集的影响，发现它并没有显著促进α-syn聚集。
重叠试验表明PAR与α-syn之间存在相互作用，但ADP核糖(ADPr)单体与α-syn之间不存在相互作用，不影响α-syn的聚集。
PARP-1能促进蛋白质的ADP核糖基化，那么它会核糖基化α-syn吗？
体外核糖基化试验(IVRA)显示没有
重叠试验和Co-IP都表明α-syn和PAR之间存在相互作用。作者通过缺失分析和Co-IP证实了α-syn通过其氨基末端与PAR相互作用。
为了探索内源性PAR产生是否能促进α-syn聚集，用N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)处理表达α-syn的原代大鼠皮层神经元，发现NMDA能激活PARP并引起α-syn聚集。而PARP-1被敲除或用PARP-1抑制剂处理后，α-syn下降。
在过表达α-syn的PARP-1 WT和PARP-1 KO细胞中外源性施用PAR可以挽救α-Syn的聚集。
在过度表达WT型α-syn和α-syn A53T的神经母细胞瘤SH-SY5Y中，通过给予PARP激活剂MNNG可以促进α-syn的聚集，但通过敲除PARP-1或给予PARP-1抑制剂可以降低α-syn的聚集，并且通过外源性补充可以类似地拯救PAR。
5?PAR增强PFF的α-syn体外毒性
已经证明PAR与α-syn PFF结合，那么这种结合会改变α-syn PFF的生物物理性质吗？
作者用K(蛋白酶K)消化用α-syn PFF和PAR-α-syn PFF处理的细胞，发现用PAR-α-syn PFF处理的细胞对PK的消化更有抵抗力，这表明PAR-α-syn PFF可能折叠得更紧。
第一部分已证明α-syn具有神经毒性，作者粗略重复了第一部分的实验，如PAR促进细胞死亡(原图S10)、促进p-α-syn的产生、促进不溶性α-syn的产生、促进α-syn的内吞和扩散(原图S11+)
6?PAR增强PFF在体内的α-syn毒性
为了探讨PAR在体内对α-syn PFF毒性的影响，作者将α-syn PFF或PAR-α-syn PFF注射到小鼠纹状体内。发现注射PAR-α-syn PFF组DA能神经元丢失，p-α-syn形成较早，p-α-syn水平明显高于注射α-syn PFF组。
此外，与α-syn PFF相比，PAR-α-syn PFF明显促进DA及其代谢产物的丢失(原图S13)，th和DAT水平下降(原图S14)，使小鼠爬杆试验和握力试验成绩变差。
7?帕金森病患者脑脊液中PAR水平升高
作者检测了PD患者和对照组两个独立队列的脑脊液PAR水平，发现PD患者脑脊液PAR水平显著升高，且PAR水平与病程有关，与Hoehn &: Yahr分期呈正相关。
此外，作者发现PD患者黑质(SN)的PAR水平也显著升高，这与以前的研究结果一致。
病理性α-syn通过激活NO合酶诱导DNA损伤和PARP-1，产生的PAR促进病理性α-syn的产生，并通过parthanatos引起细胞死亡。敲除或降低PARP-1可以抑制病理性α-syn的毒性。PAR在体内外均可增强病理性α-syn的毒性，并形成前馈循环。PD患者脑脊液和泥浆中PAR含量明显升高。这些结果表明，PARP-1的激活参与了PD的进展，因此抑制PARP-1的激活有望防止PD中DA神经元的进行性丢失。
这张图是全文的故事。
本文的套路如下图所示。
希望这篇文章能给你启发。
参考
[1]?多聚腺苷二磷酸核糖驱动帕金森病病理性α-突触核蛋白神经变性[J].科学(纽约州纽约市)，2018，362(6414)。
[2]?等.肿瘤酶对帕金森病的影响[J].科学(纽约州纽约市)，2018，362(6414): 521-522。