穆利斯和PCR在穆利斯的故事
天知道这家伙是否找到了他的心...
最后的沙皇·尼古拉斯二世，1918的流感病毒，电影《《侏罗纪公园》》，还有辛普森杀妻案。这四样东西有什么联系？答案是没有。只是近十年来生物技术的一项新发明把他们联系在了一起。这项技术被称为“聚合酶链式反应”(PCR)。
PCR最大的特点就是可以大大增加DNA的量。所以，只要能分离出一点点DNA，就可以通过PCR进行扩增和比对，不管是化石，还是历史人物的遗骸，或者是几十年前一起杀人案中凶手留下的头发、皮肤或血迹。这也是“微量证据”的力量。
PCR的原理和实践其实并不难。它利用DNA双链复制的原理，不断复制一段DNA序列，使其数量呈几何级数增长，可用于定性分析和各种应用。DNA的双螺旋结构是在1953年发现的，从此确立了它是细胞中携带遗传信息的分子。第一个细胞中用来复制DNA的聚合酶(PCR的P)也早在1956就被成功分离。几十年来，在试管中复制DNA一直是许多实验室的常规工作，但没有人想到通过PCR大量复制DNA，即使他们想到了，他们也直到1983才认为可行。
DNA复制时，必须先将两条以氢键结合的互补链分开，才能作为复制的模板。打开双螺旋最简单的方法就是加热。在高温下，双链DNA链会分离成单链，当温度下降时，互补的两条DNA链可以恢复成双链。虽然DNA分子可以耐高温，但是DNA复制需要的聚合酶是蛋白质，蛋白质在高温下会失去活性。这也是之前研究者认为这种方法不可行的原因之一。而且类似于大海捞针，从成千上万的DNA片段中，从一个已知序列组成的短引物中“抓住”所需的片段，这也是另一个让人望而却步的原因。
PCR的发明者一般公认为K. Mullis，为此他获得了1993的诺贝尔化学奖。在许多著作中，包括1990年《科学美国人》上的一篇文章，以及1998年他的自传《在心灵领域裸舞》，莫里斯都提到了PCR这个想法的起源。然而，PCR从构想到实现，真的是穆里斯一个人的工作吗？PCR是在什么情况下诞生的？
默里斯生来就是生物化学家，在加州大学伯克利分校1972获得博士学位，专攻有机合成。一大早，他就表现出桀骜不驯的性格。在那个嬉皮士时代，服用自制的迷幻药并不太稀奇，穆里斯对此很满意。更不可思议的是，他在迷幻药之旅中想出了一个解释大爆炸宇宙学的理论，写了出来并提交给了《自然》，实际上还发表了。所以他通过了博士资格考试，因为在《自然》上发表文章的教授不多，学生就更少了。至于他的博士论文，也是用口语的方式写的，还带点幽默(就像穆利斯自己说的)。如果不是宽容的教官帮他说话，恐怕要重写了。
穆里斯另一个毫不掩饰的爱好是女性，这也给他的职业生涯带来了很多转机。拿到博士学位后，他带着新婚的第二任妻子来到堪萨斯州，由于妻子的关系，他进入了该州的医学院，在那里他也找到了一份与他的心脏病学学位不匹配的工作。他很快感到厌恶，因为这个实验需要杀死许多老鼠。1975年，他和妻子离婚，和第三任妻子回到加州湾区，在第一任妻子拥有的一家面包店做了近两年的经理。直到1977我才回到加州大学旧金山分校的药物化学实验室。我仍然没有走上正确的学术道路，我也很快厌倦了我的新工作。
1979年，默里斯加入了湾区一家名为塞特斯的私人生物技术公司。当时生物技术公司还处于起步阶段，很少有学术人士愿意离开象牙塔的阴影去私企工作。就算去大药厂，也得不到大部分同龄人的认可和祝福，我觉得这就是我学术生涯的终结。但是，Sitex是一个很特别的地方。这家公司集结了一批有能力、有梦想的科学家，在自由开放的氛围下，一起朝着既定的目标前进。这和一般学院教授和实验室主持人闭门造车一意孤行的做法大相径庭。Sites雇佣Murris是因为他想依靠自己在有机化学合成方面的专业知识来合成实验用的寡核苷酸(短链DNA分子)。
自1970年代以来，由于发现了选择性切割和结合DNA分子的限制性内切酶，DNA分子可以重组，从而导致了基因工程的发展和生物技术工业的出现。因此，Sites公司从1970年代的一家主要生产维生素和抗生素的公司转变为1980年代的一家主要从事基因产品研发的公司..生长激素、胰岛素、凝血因子、干扰素、白细胞介素等。，都是Sites的研发对象。1981年，Sites正式成为上市公司，募集了大量资金。
默里斯就是在这种氛围中进入现场的。其实他做的并不是研究，只是想提高寡核苷酸合成的效率。Murris花了很多时间玩新流行的个人电脑(还不是IBM的)，经常提出奇怪的想法，大多数都是错误的。他好斗的性格和不接受批评的态度也让他到处树敌。他在工作中与异性的关系造成了很多麻烦，连劳动主管都要出面解决。1981，升任寡核苷酸合成部主管。为了增加产量和节省时间，他省略了质量管理的步骤，这引起了用户的不满，声称质量差的寡核苷酸导致了他们的研究出现问题，而穆利斯反驳说，这是用户本身能力不足。
PCR的想法就是在这样的情况下诞生的。据他自己交代，那是1983年春天的一个星期五晚上，他开车带着女朋友去乡下的一间小屋度周末。行驶在蜿蜒的乡间小路上，一幕幕DNA重复复制的场景在他脑海中弹出。默里斯认为应该有人提出这样一个简单的想法，但在搜索文献后，他发现他没有。在“顿悟”后的三到五个月里，默里斯没有采取任何行动，原因现在也不清楚。当年8月，默里斯在公司第一次做了关于PCR原理的正式报告，听众反应冷淡。第一，大家已经习惯了他的思想；而且，大多数人认为这个原理太简单了。如果可行，肯定早就有人做了。否则肯定有不可行的地方在里面，但是谁也说不清楚为什么不可行。
所以，默里斯不得不开始证明这个想法的可行性。从1983年9月开始，Murris进行了一些实验，改变了几个DNA模板，尝试了不同的加热和冷却循环。结果还不够确定。最多只是在电泳凝胶上形成一条线，未能说服别人PCR起到了越来越大的作用。65438年6月至0984年6月，默里斯因男女关系在公司制造事端，引发众怒，濒临被解雇。结果介绍他进公司的老板替他说情，只解除了他的主管职务，把他调到另一个集团，同时限制他一年内成立PCR。
任何研究方法从概念提出到实际应用所需要的精力和时间，大多被普通人低估。由于穆里斯本人没有接受过分子生物学方面的培训，公司派了技术人员来协助他，一共三个人。这些人在PCR的发展中发挥了重要作用。6月，1984，11，Muris的技术人员第一次获得了可信的结果，证明了PCR的可行性。所以在1985年初，公司决定让技术娴熟的日本技师兰德尔·斋祀加入这项工作，这是一个正确的决定。在自动化仪器出现之前，PCR是一种劳动密集型的实验方法，需要长时间的重复操作，手脚不好的人做不了。有才木的结果是干净漂亮，让人没有怀疑。
到了1985的春天，Sites的高层已经对PCR的潜力深信不疑，开始担心消息泄露(穆里斯自己也是大嘴巴)，好让别人先下手为强。3月份，他们发出了第一份专利申请，他们也准备在5438年6月+10月举行的美国遗传学会年会上报告成果，但只有在交付前写一份正式论文才安全。他们决定写两篇文章，一篇是关于PCR的理论，最早是Murris发表的，第二篇是关于PCR的应用，重点是蔡穆的实验结果，然后介绍。结果，默里斯整个夏天都在玩电脑，一次又一次推迟论文的写作。到9月下旬另一篇申请文章写出来并发表的时候，Murris还没有搬走。所以第一篇提到PCR的方法的论文发表在1985年2月20日的《科学》杂志上，共有七位作者，其中穆里斯排名第四。
直到5438年6月+当年2月，莫里斯才写好论文，提交给《自然》。但是Murris忘记给编辑附上一封信，当然他也没有解释这篇文章和《科学》杂志上的文章有什么不同，所以他被拒绝了。震惊之余，他转投《科学》杂志，在Sitters主管的帮助下给编辑写了一封信，但稿子还是被拒绝了。这时，莫里斯将怒火转向公司，认为这是公司的阴谋，想窃取他发明PCR的功劳。科学发明的优先权和功过之争，在科学史上可谓层出不穷，常说公婆有几分道理。不仔细考察背景和过程，仅凭后人记载的几句话，很难知道真相。至于PCR的概念是Murris的结晶，没有人有任何异议，只是实现概念的过程要复杂得多。
在Morris的文章被拒绝两次后，公司里有人建议投票支持酶学方法，主要是因为有人与杂志主编吴瑞很熟悉，有良好的沟通。同时，PCR的性质也适合强调方法学的刊物。结果Murris的文章终于发表了，但是晚了整整一年，直到1987年初才出来。这篇文章中只提到了莫里斯和另一名技术员的名字。
为了表明他们无意争功，Sites主任向冷泉港实验室的Watson(DNA双螺旋结构的发现者之一)推荐Muris在5月举行的“人类分子生物学”研讨会上报告PCR的原理和实际应用结果1986。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，分子生物学领域的知名人士也到场。结果他表现很好，建立了PCR是Murris发明的印象。《冷泉港研讨会》特刊出版于1986年底，在《酶学方法》一文之前，莫里斯是第一个。
从此，PCR的名字及其强大的应用广为人知。然而，将PCR转变为真正成熟的技术的关键是引入耐热的DNA聚合酶。
如前所述，在PCR的操作中，需要反复进行加热和冷却的步骤，前一个循环使用的大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会发生变性，所以每次冷热循环后都要加入新鲜的聚合酶。这种做法不仅麻烦，而且昂贵。按照当时的价格，聚合酶一个周期需要的价值是1美元，30个周期后就是30美元，再多周期就更差了。因此，在1986年的春天，Mullis首先提出了使用耐热酶的想法。经过文献检索，我找到了两篇相关文献，更早的一篇是美国做的，另一篇是俄罗斯科学家的成果，用俄语发表。
分离耐热DNA聚合酶的第一份报告是来自台湾省的年轻科学家的第一次尝试。65438到0973，钱佳韵随着留学热潮去了俄亥俄州辛辛那提大学生物系。她的导师J. Trela对黄石国家公园温泉中发现的一种嗜热细菌感到好奇，于是她请钱和另一名美国学生将这种细菌作为论文的主题。在另一位老师的指导下，钱学会了从细胞中分离蛋白质，成功分离出耐高温的Taq DNA聚合酶。
钱在1975获得硕士学位后，转入美国爱荷华州立大学获得神经生物学博士学位，并于1982回到阳明医学院神经科学研究所任教，至今已有20年。这项历史性的工作发表在1976的《细菌学杂志》上。她是第一作者，但用的是英文名Alice，后来又挂上了丈夫的姓(Chang)，以至于没有多少人知道这篇被广泛引用的文章的作者是A. Chien。
虽然莫里斯建议将Taq DNA聚合酶应用于PCR，但当时还没有，所以他必须自己想办法分离出来。司徒有一整套分离蛋白质的设备，也有人愿意指导他，但默里斯是个拖延症患者。等了几个月，公司的其他人只好自己动手，按照钱等人发表的步骤，三周就分离出了纯化的Taq DNA聚合酶，1986年6月，蔡母第一次将其应用于PCR，效果惊人，可以说是一战成功，Taq DNA聚合酶不仅大大简化了PCR工作，而且比以前使用的酶具有更强的特异性和活性，背景噪音几乎被消除。从此，PCR取得了圆满成功。
从那以后，莫里斯和西特斯的关系恶化了。他不认为自己在发表文章的过程中有任何错误，他要求未来五年PCR发表的所有文章都要有他的名字。他还在公开场合批评公司的其他人。最后，Murris在9月离开了网站，1986。Sites给了他5个月的工资和1万美元的奖金，但按照行业惯例，PCR的专利权属于Sites公司。
离开Sites后，Murris继续担任一些生物技术公司的顾问，但从未发表过正式论文。据他说，PCR是他自己发明的。获得诺贝尔奖后，我并没有听到太多其他的声音。19911 2月，霍夫曼罗氏制药有限公司涉嫌以3亿美元买下了Sites的PCR技术专利，Sites公司也由此进入历史。直到最近几年，由于钱家云等人发表的工作，Taq DNA聚合酶的专利受到挑战，PCR的专利也受到影响，不过那是后话了。