核酸电泳的分类
当凝胶置于电场中时，带电的核酸在中性pH下通过凝胶的网格迁移到阳极，迁移速率受分子大小、构象、琼脂糖浓度、施加的电压、电场、电泳缓冲液和嵌入的染料量的影响。在不同条件下电泳适当时间后，不同大小和构象的核酸片段会在凝胶上处于不同的位置，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶分离范围广，各种浓度的琼脂糖凝胶都可以分离200 BP-50kb长度的DNA。
2.琼脂糖凝胶电泳的仪器和试剂应包括卧式凝胶电泳槽及其配套的电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备了紫外线探测器和摄像系统。
试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液和凝胶加载缓冲液。
电泳缓冲液通常为TBE(1 000ml含5.4g Tris，2.75g硼酸，2ml 0.5 mol/L EDTA，pH8.0)。
溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，可嵌入双链核酸的成对碱基之间，电泳时随核酸片段迁移。当凝胶置于紫外光下时，插入核酸链的EB在紫外光的激发下产生红色荧光，可以清楚地显示每个核酸片段的迁移情况。EB易被光分解，应保存在4℃的棕色试剂瓶中。由于EB是一种强诱变剂，毒性中等，必须戴手套操作。
常用的凝胶上样缓冲液有四种，如下表所示:凝胶上样缓冲液缓冲液类型6×缓冲液配方保存温度ⅰ0.25%溴酚蓝。
0.25%二甲苯蓝
40%(W/V)蔗糖水溶液4℃ⅱ0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯蓝
15%(W/V)蔗糖室温水溶液ⅲ0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯蓝
4℃30%(W/V)甘油溶液ⅳ4℃40%(W/V)蔗糖溶液3。凝胶的制备和电泳。
操作方法如下:
(1)用透明胶封住装有电泳装置的玻璃板或塑料盘的边缘，制成胶模，放在水平工作台上；
(2)称取适量琼脂糖，置于电泳缓冲液中，加热溶解琼脂糖；
(3)当溶液冷却至60℃时，加入10mg/ml EB贮存液，使终浓度达到0.5mg/ml；
(4)将电泳梳放在距塑料模具底板0.5-1mm处，将琼脂糖溶液倒入塑料模具中，厚度约为3-5mm，注意避免气泡；
(5)凝胶完全固化后，取下梳子和透明胶，将凝胶放入电泳槽中。加入TBE缓冲液，使其刚好通过粘合表面约1mm；
(6)将DNA样品与1/6体积的加样缓冲液混合，加入样品罐中；
(7)接通电源，使样品槽在负端，用1-5v/cm的电压电泳适当时间；
(8)电泳后，含EB的凝胶可直接放在紫外检测器上观察并拍照记录，或不含EB的凝胶在0.5μg/ml EB溶液中染色30-45分钟，再按上述方法观察并拍照，可记录结果。
4.凝胶摄影
需要配置135相机，全色135胶片，相机支架，特写镜头和红色滤镜，有机玻璃防护口罩。
手术需要在暗室里进行。固定好相机，把凝胶放在紫外检测器上合适的位置，对焦，装上红色滤镜，照常拍照。
也可以使用自动凝胶处理系统，但仪器成本高。
5.纯化5。EB解决方案
由于EB具有一定的毒性，实验结束后，含EB的溶液要经过提纯后再丢弃，以免污染环境，危害人体健康。
(1)EB含量大于0.5μg/ml的溶液可按如下方式处理:
(1)用水将EB溶液稀释至浓度低于0.5μg/ml；
(2)加入1体积0.5mol/L的KMnO4，混匀，加入等体积25mol/L的HCl，混匀，室温下静置数小时；
③加入1倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀后弃去。
(2)EB含量小于0.5μg/ml的溶液可按如下方式处理:
(1)按1mg/ml的量，加入活性炭，不时轻轻摇匀，室温放置1小时；
②用滤纸过滤，用滤纸封住活性炭，丢弃。1.原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵和交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺通过化学反应形成的。丙烯酰胺单体在催化剂作用下聚合形成长链，长链通过交联剂交联形成凝胶，其孔径大小由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度，通过调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比可以改变聚合物的交联度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据电泳样品的电荷、分子大小和形状的不同达到分离的目的，兼具分子筛和静电效应，比琼脂糖凝胶电泳分辨率更高。可以分离出仅相差1个核苷酸的DNA片段。
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于1kb的DNA片段。根据待分离核酸片段的大小，可以制备不同浓度的凝胶。
2.凝胶制备和电泳由于氧气能抑制丙烯酰胺的聚合，聚丙烯酰胺凝胶的填充往往在两块封闭玻璃板形成的夹层之间进行。在这种装置中，只有顶层的凝胶与空气中的氧气接触，从而大大降低了氧气对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用立式装置。
凝胶制备和电泳操作如下:
(1)制备试剂
① 30%丙烯酰胺:100ml双蒸水含29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺。
②每升5× TBE溶液含54g Tris。盐酸、27.5克硼酸和20毫升0.5摩尔/升EDTA(pH8.0)。
③ 10%过硫酸铵:10ml双蒸水含1g过硫酸铵。
(2)将玻璃板和垫条预先在装置的橡胶模具中用洗涤剂擦洗，用自来水和去离子水冲洗，干燥。安装时，将较大的玻璃板平放在工作台上，在玻璃板两侧各放两个垫板，涂上少量凡士林，将上玻璃板放在垫板上，用夹子夹住玻璃板和垫板，底部用1%琼脂糖密封。为了防止漏胶，除了梳子的一面，其他三面都要用防水胶带封好。
(3)根据玻璃板尺寸和夹层厚度计算所需凝胶溶液量，并根据下表配制溶液(100ml)。聚丙烯酰胺凝胶溶液的浓度为3.5 5.0 8.0 12.0 20.0 30%丙烯酰胺(毫升)116.626.40.066水(毫升)。67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5×tbe(ml)20.0 20.0 10%过硫酸铵(ml)0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7向100ml混合溶液中加入35μl TEMED并混合。
(4)立即插入电泳梳，防止梳齿下形成气泡。
(5)室温下聚合65438±0小时，梳齿下出现折射带，表明聚合反应已完成。凝胶如不立即使用，可用纱布或滤纸覆盖(浸泡在1×TBE中)，4℃保存1-2天。
(6)拔出梳子，立即用水冲洗加样孔。
(7)取下底部胶带，将凝胶垂直放入电泳槽中。用1×TBE溶液填充上下罐，驱除附着在凝胶底部的气泡。用1×TBE溶液清洗加样孔；
(8)将核酸样品与适量的6倍凝胶上样缓冲液(见表2-28)混合，加入凝胶上样孔；
(9)接通电源，阳极与下槽连接。电压一般控制在1.8v/cm。当电压过高时，凝胶产生的热量会导致DNA条带弯曲，甚至导致小的DNA片段熔化。
(10)电泳结束后，取下玻璃板和凝胶，放在工作台上，从夹层的一角轻轻撬开，轻轻取下上面的玻璃板，小心取出凝胶，在染色液中染色，观察结果。
3.凝胶染色和观察聚丙烯酰胺凝胶中核酸带的染色，常用溴化乙锭法和银染法。前者的染色方法与琼脂糖凝胶相同。
银染法灵敏度高，操作如下:
(1)将凝胶固定在静止溶液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)中10分钟；
(2)双蒸水洗1-2次；
(3)将其放入0.01mol/L的AgNO3溶液中，在室温下反应1.5-30分钟；
(4)充分洗涤；
(5)放入NaOH-甲醛混合溶液(200ml 3% NaOH，含1ml甲醛)中反应至条带颜色清晰，背景适宜；
(6)用5%冰醋酸终止反应。