在PCR技术发明之前，人们是如何进行分子克隆的？

科恩伯格最引人注目的研究工作是在20世纪50年代中期通过实验证明了DNA的复制并分离出复制所需的酶，这体现在他于1956年发表的著名论文《脱氧核糖核酸的酶促合成》中，为此他获得了1959年诺贝尔生理学和医学奖。？

在1953之前，基因的物质本质一直是困扰全世界生物学家的问题。1953年4月25日，《自然》发表了J. Watson和F. Crick的DNA双螺旋结构模型，不仅体现了DNA分子的无限多样性，而且立即提出了DNA分子自我复制的可能机制，使生物学家一下子接受了基因的物质本质是DNA。然而，尽管DNA双螺旋结构模型是基于许多实验结果，但它仍有待实验证明。特别是DNA真的是一种自我复制的分子吗？DNA双螺旋结构的模型发表后，科恩伯格以此模型作为他想象的基础，用实验方法研究DNA复制，很快获得成功，并在1956中发表了初步结果。他成功的原因之一是他有一个正确的分析:他认为虽然组成DNA分子的单体是四种脱氧核苷单磷酸，但合成DNA的原料不是四种脱氧核苷单磷酸，而是四种脱氧核苷三磷酸。四种脱氧核苷三磷酸缺乏1，四种脱氧核苷二磷酸或四种脱氧核苷一磷酸不可。他还假设细胞中一定有合成DNA所需的酶。于是他研磨大肠杆菌，加入四种脱氧核苷三磷酸(其中至少有1被放射性同位素标记以检查实验结果)并加入一点点DNA作为“模板”(如小牛胸腺DNA、大肠杆菌DNA和大肠杆菌T2噬菌体DNA)。混合溶液在镁离子存在下，37℃静置30分钟，发现放射性标记已进入DNA部分，说明有新合成的DNA分子。新合成的DNA分子，即实验产物，可以用高氯酸沉淀法从脱氧核苷三磷酸单体原料中分离出来。科恩伯格测定了产物DNA的碱基组成，发现它们与各自的模板DNA组成惊人地相似，这充分证明了新合成的DNA的特异性是由加入的少量模板DNA决定的，但数量却大大增加了。DNA确实是一种自我复制的分子！

对了，后来人们知道，DNA合成也需要“引物”提供3’-末端羟基，让DNA聚合酶从那里聚合脱氧核苷酸，形成DNA。科恩伯格当年对模板DNA进行了化学处理，造成了一些断裂，从而形成了一些现成的3’-末端羟基。这在当时是未知的。？科恩伯格获得诺贝尔奖后并没有停下脚步。他明明知道自己体外合成的DNA是无活性的。那么，我们能在体外合成活性DNA分子吗？1967年，他以大肠杆菌φⅹ174的噬菌体DNA为材料，进行体外复制实验。φⅹ174的基因组是一个单链环状DNA，共有5 386个核苷酸。细胞内的情况是，当φⅹ174感染大肠杆菌时，单链环状DNA进入细菌，其互补链根据碱基配对原理迅速合成，形成双链环状“复制DNA”。一般噬菌体颗粒中的单链称为“+链”，进入细菌后合成的互补链称为“-链”。在细菌中复制时，以-链为模板，用“滚环”法合成了许多+链。这些+链和蛋白壳构建成新的φ ⅹ 174，从细菌中释放出来。科恩伯格基本上还是使用1956中使用的方法(但加入了连接酶，将新合成链最后一个核苷酸的3’-末端羟基与第一个核苷酸的5’-末端磷酸基团连接成环)，以φ ⅹ 174+DNA为模板体外合成-链，再以-链为模板体外合成。体外合成的φ ⅹ 174+链DNA可以感染大肠杆菌，在细菌中复制，最终从细菌中释放出许多φ ⅹ 174噬菌体颗粒，具有原始φⅹ174噬菌体的所有特征。于是，人类第一次在试管中合成了具有生物活性的DNA分子。科恩伯格在体外DNA合成方面的成就影响深远。第一个是关于DNA复制所需的酶。？

科恩伯格在实验之初设想的大肠杆菌提取液中所含的DNA聚合酶，是他在1957中分离纯化出来的，即“大肠杆菌DNA聚合酶I”，又称“科恩伯格酶”，至今仍被世界各地的分子遗传学实验室普遍使用。它不仅具有聚合酶的活性，还具有5′→3′核酸外切酶和3′→5′核酸外切酶的活性。今天，当我们利用DNA分子杂交技术进行基因分离、基因结构分析、基因诊断等研究时，要使用放射性同位素标记的基因探针；常用的标记基因探针的缺口翻译法是利用大肠杆菌DNA聚合酶ⅰ同时具有聚合酶活性和5′→3′核酸外切酶活性的特性，其反应过程也是在科恩伯格体外合成DNA的过程。所以，虽然后来证明大肠杆菌DNA聚合酶ⅲ在大肠杆菌细胞的复制中起主要作用，而不是DNA聚合酶ⅰ，但在分子遗传学实验室中，大肠杆菌DNA聚合酶ⅰ的重要性处于实验室常用酶的前列。？

1970年，丹麦生物化学家H.Klenow用枯草杆菌蛋白酶切割大肠杆菌DNA聚合酶ⅰ，电泳后得到两个片段。大片段保留了聚合酶和3′→5′核酸外切酶的活性，但失去了5′→3′核酸外切酶的活性，称为“克莱诺夫片段”，又称“克莱诺夫酶”。另一种通常用于标记基因探针的“随机引发”方法必须使用克莱诺夫酶而不是科恩伯格酶。其次，科恩伯格的成就直接导致了一些获得诺贝尔奖的项目。？

到目前为止，包括2003年4月完成的“人类基因组计划”在内，已经测定了噬菌体、病毒、类病毒、细菌、原生菌、真菌、植物、动物、细胞器和质粒的65，438+0，000多种基因组DNA序列。DNA测序始于英国生物化学家f·桑格在1975年建立的“加减法”，他在1977年首次用这种方法测定了φ ⅹ 174基因组DNA的全核苷酸序列。30年来，DNA测序从半自动发展到仪器自动测序，但其基本原理仍然没有跳出桑格的“加减法”范畴，“加减法”的“源头”是科恩伯格的体外DNA合成实验。它试图控制DNA的酶促合成产生不同长度的互补链，从而决定一个核苷酸的排列顺序。其中，使用的DNA聚合酶是Klenoff酶。桑格因为建立了DNA测序方法获得了1980诺贝尔化学奖。